（内科学专业论文）甘草次酸对k562细胞抑制作用及机制的初步研究.pdf

j 1 1 11 1i iiiiiit i lli iiii 18 9 2 7 5 4 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言8日u 舌”8 材料与方法8 实验结果1 2 讨论1 7 结论2 0 四、本研究创新性的自我评价2 l 五、参考文献2 2 六、附录 3 o 1 2 2 3 3 3 绩 一 一 成 fl 砂 利 一 一 问 介 一 期 一 简述学谢人综在致个 中文论著摘要 甘草次酸对k 5 6 2 细胞抑制作用及机制的初步研究 目的 研究甘草次酸对髓系白血病细胞系k 5 6 2 体外增殖抑制及凋亡诱导作用，分 析甘草次酸对s u r v i v i n 、p 3 8 基因及蛋白的影响，进一步探讨其可能的抗癌机制。 方法 一、细胞培养 细胞应用1 6 4 0 培养基培养于3 7 c ，5 c 0 2 的恒温培养箱中。细胞隔日换液传 代1 次，取处于对数生长期且台盼蓝拒染法测定活性在9 0 以上的细胞进行实验。 二、m t t 细胞毒实验检测药物对细胞抑制作用 将g a 用p b s 稀释成1 5 m m o l l 母液分装待用。取k 5 6 2 细胞计数，对照组加入不 含药液的培养基1 0 0 u l ，空白组加入p b s 溶液l o o u l ，实验组加入1 0 0 u l 用1 6 4 0 培养 液稀释的1 2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 、1 2 5 、1 5 0u m o l l 甘草次酸工作液。分别培养1 2 h ， 2 4 h ，4 8 h ，7 2 h 后按试剂盒说明进行操作，酶标仪上测量波长5 7 0 n m 处各孔o d 值。 计算细胞抑制率，实验重复5 次。 细胞增殖抑制率= ( 实验组空白组) ( 对照组空白组) x 1 0 0 三、h o e c h s t3 3 2 5 8 染色法观察细胞凋亡的形态学改变 将细胞用5 0 u m o l l 及l o o u m o l l 甘草次酸工作液培养2 4 1 时，同时设立阴性对 照。h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色在激光共聚焦显微镜下观察细胞核形态变化。照相保存。 实验重复3 次。 四、流式细胞仪分析检测细胞周期 计数1 0 5 数量级细胞，分别用1 0 0 u m o l l 甘草次酸工作液培养1 2 h 、2 4 h 和4 8 h 。 同时设立对照组。p i 单染后上机检测。调整流式细胞仪变异系数在3 一下，用c e l l m o d i f i t 软件分析细胞周期。实验重复3 次。 五、流式细胞分析仪检测细胞凋亡 计数1 0 6 数量级细胞0 5 r n l ，分别用1 5 0 u m o l l 甘草次酸工作液i m l ，培养0 、1 2 、 2 4 、4 8 h 。同时设立对照组，进行a n n e x i nv p i 双染后上流式细胞仪检测。 六、w e s t e r nb l o t 测s u r v i v i n 及p 3 8 蛋白 收集对照组和药物作用组( 甘草次酸1 5 0 p s n o l l 作用2 4h 细胞) ，w e s t e r nb l o t 方法检测甘草次酸对k 5 6 2 细胞s u r v i v i n 及p 3 8 蛋白表达的影响。用凝胶成像系统 分析软件q u a n t i t yo n e 测灰度值，进行结果分析。 七、r t p c r 检测s u r v i v i n 及p 3 8 m r n a 的表达 收集对照组和药物作用组( 甘草次酸1 5 0 i t r n o l l 作用2 4 ”细胞，提取细胞总 r n a ，反转录得到对应的c d n a 。应用r e a lt i m ep c r 扩增仪进行扩增反应，记 录循环阈值( c t 值) ，计算s u r v i v i n 及p 3 8 基因的相对表达量。 结果 一、甘草次酸对k 5 6 2 细胞增殖的影响 甘草次酸对k 5 6 2 细胞有显著的增殖抑制作用，呈剂量和时间依赖关系。 二、甘草次酸对k 5 6 2 细胞凋亡的形态学变化 甘草次酸对k 5 6 2 细胞有促凋亡作用。5 0 u m o l l ，1 0 0 u m o l l 甘草次酸工作液 培养2 4 小时的细胞及未经甘草次酸作用的对照组细胞应用h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色后 在激光共聚焦显微镜下显示：细胞核呈现不同程度的晚期凋亡特征，表现为染色 质浓缩，体积变小，变形，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。随着药物浓度的增 加，凋亡特征表现显著。 三、甘草次酸对k 5 6 2 细胞周期的影响 甘草次酸作用于细胞1 2 、2 4 、4 8 小时后，细胞周期发生改变。随着药物作用 时间延长，主要表现为g l 期细胞阻滞，g l 期细胞数增多，g 2 期减少，s 期变化 不明显，g a 各剂量组之间存在统计学差异。 2 四、流式细胞仪检测甘草次酸对k 5 6 2 细胞凋亡的变化 与空白对照组相比，不同剂量g a 诱导k 5 6 2 细胞后在细胞存活数，细胞坏死 数上均无显著差别。凋亡细胞数各组比较p 小于o 0 5 ，具有统计学差异显著性。 五、g a 能上调l ( 5 6 2 细胞中p 3 8 蛋白的表达，降低s u r v i v i n 蛋白 的表达 与空白对照组相比，g a 组p 3 8 积分光度值有较明显的上升，差异均具有统计学 意义( p 0 0 5 ) ；g a 能降低k 5 6 2 细胞中s u r v i v i n 蛋白的表达；与空白对照组相比， g a 组s u r v i v i n 积分光度值有较明显的下降，差异均具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 六、g a 对l ( 5 6 2 细胞s u r v i v i n 基因及p 3 8 基因m r n a 表达的影响 实时定量r t - p c r 结果显示，s u r v i v i n 基因m r n a 与对照组比值为0 3 5 2 ，加 入g a 组s u r v i v i n 基因m r n a 水平明显下降；p 3 8 基因m r n a 与对照组比值为 1 8 2 5 ，加入g a 组p 3 8 基因m r n a 水平明显上升。 结论当日f 匕 甘草次酸能抑制k 5 6 2 细胞增殖，并诱导k 5 6 2 细胞凋亡，具有时间和剂量依赖 关系。其机制可能与抑制s u r v i v i n 基因、激活p 3 8 基因有关，有望成为新型抗肿 瘤药物。 关键词 甘草次酸；白血病；细胞凋亡；s u r v i v i n ；p 3 8 3 英文论著摘要 t h e i n h i b i t o r ye f f e c t so fg l y c y r r h e t i ca c i do nt h e g r o w t ho ft h ek 5 6 2c e l la n di t sm e c h a n i s m s o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c tso fg l y c y r r h e t i ca c i d ( g a ) o nt h ep r o l i f e r a t i o ni nk 5 6 2 c e l l si nv i t r oa n de x p l o r et h ep o s s i b l em e c h a n i s m s m e t h o d s 1 c e l lc u l t u r e t h ek 5 6 2c e l l sw e r ec u l t u r e di nr p m i16 4 0m e d i u mw i l5 c a r b o nd i o x i d e3 7 c o n s t a n tt e m p e r a t u r ei n c u b a t o r t h ec e l l sw e r ec h a n g e dm e d i u ma n dg od o w nt o p o s t e r i t ye v e r yo t h e rd a y t oc a r r yo u te x p e r i m e n tw i t he x p o n e n t i a lp h a s eo fg r o w t h c e l l s ，a n dt h e i ra c t i v i t yi sa b o v e9 0 s u r v e y e db yt r y p a n b l a ur e f u s i n gt od i e 2 c e l lp r o l i f e r a t i o nw a sd e t e c t e db ym t ta s s a y g aw a sd i l u t e d15m m o l lb yp b sa n d w a ss u b p a c k a g e dt ou s e t h ee x p e r i m e n t w a sd i v i d e di n t o6g a c o n c e n t r a t i o n - g r o u p s 弱c o n t r o l l 2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 、1 2 5 、1 5 0 u m o l l g aa n d4t i m e g r o u p s 勰12 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h m e a s u r i n go dv a l u e sw i t h5 7 0 n m s e n z y m es c a l er i t e t oc a l c u l a t ec e l li n h i b i t i o nr a t i o 3 h o e c h s t3 3 2 5 8 s t a i n i n gr e v i e wa p o p t o t i cm o r p h o l o g yc h a n g e k 5 6 2c e l l si n d u c e db y10 0 u m o l lg af o r2 4h o u r s ，m e a n w h i l en e g a t i v ec o n t r o l w a ss e tu p n u c l e u sm o r p h o u sw a so b s e r v e du n d e rl a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p ya f t e r h o e c h s t3 3 2 5 8s t a i n i n ga n dp i c t u r e sw e r et a k e n 4 f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) t od e t e c tc e l lc y c l e c o u n t i n g10 5o r d e ro fm a g n i t u d ec e l l s ，t h a tw e r es e p a r a t e l yt a k e na f t e rt r e a t e db y lo o m o l lf o r12 h ，2 4 ha n d4 8 h m e a n w h i l ec o n t r o lg r o u pw a ss e tu p t od e t e c ta f t e r 4 p is i m p l es t a i n i n g a d j u s t e df c mc o e f f i c i e n to fd i f f e r e n t i a t i o nb e l l o w3 ，a n da n a l y s i s c e l lc y c l ew i t hc e l lm o d i f i ts o f t w a r e 5 f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) t od e t e c tc e l lp o p t o s i s c o u n t i n g10 5o r d e ro fm a g n i t u d ec e l l s0 5 m l , t h a t w e r es e p a r a t e l yt a k e na f t e r t r e a t e db y15 0 m o l lg af o r12 ha n d2 4 h m e a n w h i l ec o n t r o lg r o u pw a ss e tu p t o d e t e c ta f t e ra n n e x i nva n dp id o u b l es t a i n i n g 6 w e s t e r nb l o tf o ra n a l y s i so f s u r v i v i na n d p 3 8p r o t e i n s c e l l sw e r et a k e na f t e rt r e a t e db y15 0 p m o l lg a f o r2 4 h w e s t e r nb l o ta n a l y s e s u r v i v i na n dp 38p r o t e i n sb yg e l a t u mi m a g i n gs y s t e ma n a l y s i ss o f t w a r eq u a n t i t yo n e w i t hg r a ys c a l ev a l u e s 7 r e a l t i m e p c rt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i n a n dp 3 8 i n r n a s c e l l sw e r et a k e na f t e rt r e a t e db y15 0 1 a m o l l g af o r2 4 h t h et o t a lr n aw a s e x t r a c t e da n dt h e nt r a n s c r i p t e dr e v e r s e l yi n t oc d n aa n df i n a l l ya m p l i f i c a t e di np c r a m p l i f i c a t i o ne q u i p m e n t t ot a k en o t e sc i r c u l a t i o nt h r e s h o l d ( c t o p t i m t t m ) ，c a l c u l a t i n g s u r v i v i na n dp 38g e n i ec o r r e s p o n d e n c ee x p r e s s i o n r e s u l t s 1 t h ee f f e c t so fg l y c y r r h e t i ca c i do nt h eg r o w t ho ft h ek 5 6 2 g a p r e s e n t e dt h es t r i k i n gp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o n , a sw e l la sa p o p t o s i si n d u c ti o n p o t e n c y o nk 5 6 2c e l l s nv i t r oi nat i m e a n dd o s e d e p e n d e n tm a n n e r 2 t h ea p o p t o t i cm o r p h o l o g yc h a n g eo fk 5 6 2c e l la f t e rr e d u c e db yg a g ai n d u c e da p o p t o s i si nk 5 6 2c e l l s a f t e rt r e a t e db y5 0 1 a m o l l 、10 0 1 a m o l l g a f o r2 4 h ，t h ec e l l sr e v i e wa p o p t o t i cm o r p h o l o g yc h a n g eb yh o e c h s t3 3 2 5 8s t a i n i n g u n d e rl a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p y w h i c hs h o wc a r y o t i nc o n c e n t r a t i o n , b u l ks 呲 a l l a x i s ，c e l ln u c l e u sk a r y o r r h e x i s ，a p o p t o t i cb o d y t h e m o r ed r u gl e v e l , t h em o r e s i g n i f i c a n tt h ea p o p t o s i sc h a r a c t e r i s t i c sa r e 5 3 t h ek 5 6 2c e l lc y c l er e d u c e db yg a t h ec e l lc y c l ec h a n g e da f t e rt r e a t e db yg af o r12 h 、2 4 ha n d4 8 h c e l l st r e a t e d 、析m g as h o w e dt h ea c c u m u l a t i o ni ng 1p h a s e ，r e d u c t i o ni nt h ep e r c e n t a g eo fc e l l si ng 2 p h a s ea n dn os i g n i f i c a n tc h a n g ei nsp h a s e ，e x c e p tal i t t l er e d u c i n gi ng r o u pw i t h m a x i m u mc o n c e n t r a t i o no fg a 4 f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) t od e t e c tc e l lp o p t o s i s t oc o n t r a s tb l a n kg r o u p ，g ag r o u p si nc e l ls u r v i v a lr a t ea n dt h en u m b e ro f c e l l u l a rn e c r o s i sa r en os i g n i f i c a n td i s t i n c t i o n o na p o p t o s i sc e l l ，pi s0 0 3 ，s t a t i s t i c s d i s t i n c t i o ni ss i g n i f i c a n t 5 g au p - r e g u l a t i o np 3 8p r o t e i na n dd o w n - r e g u l a t i o ns u r v i v i n p r o t e i n t oc o n t r a s tb l a n kg r o u p ，g ag r o u pp 3 8i n t e g r a li n t e n s i t yo fl i g h te v i d e n t u p g r a d e s t a t i s t i c sd i s t i n c t i o ni ss i g n i f i c a n t ( p 1 8 ) 。加入随机引物及 逆转录酶合成c d a n 链。取c d a n2 u l ，加入s y b rp r e m i xe xt a qi i ( 2 x ) 10 u l ，加入 r o xr e f e r e n c ed y e 1 1 0 4 山，加入上下游引物各0 8 山，灭菌双蒸水将反应体系补足 至2 0 1 x l 。t h e r m o p x 2 型p c r 仪进行扩增，以p a e t i n 作为内参照。反应条件为：预变性 9 5 。c 0 5m i n , 9 5 c 变性5 s ，1 个循环，6 0 c 退火延f 3 4 s ，4 0 个循环，最后延伸1m i n 。 各引物序列分别为：s u r v i v i n 上游引物：5 c t g c g g a g u a c 玎g c g 3 ，下游引物： 5 础a 觚aa a c c ( 麟a a g 3 目的基因l l o b p 。p 3 8 上游引物：5 - a c c a c a g a g c c g a c c a c - 3 ，目的基因1 0 0 b p 。即l c i j n 上游引物为：5 a a g g c t g t g g g c a a g g - 3 ，下游引物为5 - k 晒ag g ：a g r ( 晒( 玎g t c g 3 ，扩增 产物为2 3 8 b p 。扩增产物作定量分析。 实验结果 一、甘草次酸对k 5 6 2 细胞增殖的影响 甘草次酸k 5 6 2 细胞有显著的生长抑制作用，且该作用呈量效和时效关系( 图1 及图2 ) 。运用重复测量方差分析得出不同时间组t i m ep i l l a l st r a c e 为0 9 9 7 ，p 小于 0 0 1 ；三个时间不同浓度下的检测结果t i m ep i l l a l st r a c e 为1 9 6 ，p 小于0 0 1 。具有线 性拟合性，t i m ec c m c e n l r a t i o nl i n e a r 为o 3 7 ，p 小于0 0 1 。差异均有统计学意义。 图1 ，不同浓度甘草次酸对飚6 2 细胞抑制率( 灶s 萨5 ) 。横坐标单位u m o l l 1 2 图2 ，不同浓度甘草次酸对k 5 6 2 细胞抑制率( x 士- s ，舻5 ) ，1 - 6 表示 1 2 5 ，5 0 ，7 5 ，1 0 0 ，1 2 5 ，1 5 0 u m o l l 二、甘草次酸对k 5 6 2 细胞凋亡的形态学变化 甘草次酸对k 5 6 2 细胞有促凋亡作用。5 0 u m o l l ，1 0 0 u m o l l 甘草次酸工作液 培养2 4 d , 时及对照组细胞经h o e c h s t 染色后在激光共聚焦显微镜下显示，细胞核呈 现不同程度的晚期凋亡特征，表现为染色质浓缩，体积变小，变形，细胞核裂解为 碎块，产生凋亡小体。随着药物浓度的增加，凋亡特征表现越为显著( 图3 ) 。 图3 ，左图：5 0 u m o l l 甘草次酸工作液培养2 4 小时经h o e c h s t 染色后在激光共 聚焦显微镜下凋亡特征。右图：1 0 0 u m o l l 甘草次酸工作液培养2 4 d , 时经h o e c h s t 染色后在激光共聚焦显微镜下凋亡特征。 1 3 三、甘草次酸对k 5 6 2 细胞周期的影响 甘草次酸作用于细胞1 2 、2 4 、4 8 p b 时后，细胞周期发生改变。随着药物作用 时间延长，主要表现为g l 期细胞阻滞，g l 期细胞数增多，g 2 期减少，s 期变化不 明显，g a 各剂量组之间存在统计学差异。结果见表1 及图4 。 表l ，1 5 0 u m o f l 甘草次酸对k 5 6 2 细胞周期的影响 g l 期不同时间组比较，f = 1 2 2 5 9 7 9 1 ，p j , , 于o 0 l ，统计学差异有显著性。 i i id o一” 鲁争毒善f亭 昌旷 g - 辱 。垂 j l 垂 鲕z l _ 手 c 矧 月 、一l - 患热一：0 一 j ：o 二蠢二 。一二 怎二。二。 。：_ ；厶二。二 图4 ，a 为加1 5 0 u m o f l 药物培养1 2 h p i 单染测周期；b 为加1 5 0 u m l l 药物培养 2 4 h p i 单染测周期；c 为加1 5 0 u m o f l 药物培养4 s h p i 单染测周期。 四、流式细胞仪检测甘草次酸对k 靳2 细胞凋亡的变化 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如p i 有抗染性，坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的d n a 可被p i 着染产生蓝荧光，而细胞膜保持完好的细胞则 不会有蓝荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期p i 不会着染而没有蓝色荧光信号。 正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞， 为( f i t c - p i ) ：右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为( f i t c + p i + ) ；而右下象 限为凋亡细胞，显现( f i t c + p i ) 。g a 诱导k 5 6 2 细胞用单因素方差分析，与对照 组比较，g a 次酸诱导k 5 6 2 细胞在存活率，坏死细胞数均无显著差别。凋亡细胞 p = 田0 3 ，统计学差异显著性。见表2 及图5 。 1 4 表2 ，流式细胞仪检测15 0 u m o l l g a 作用下k 5 6 2 细胞凋亡率变化 l 孽 赫 曩 图5 ，a ：空白对照；b ：力1 1 5 0 u m m o l l 药细胞培养1 2 d , 时f i t c p i 双染；c ：加 15 0 u m o l 药物培养2 4 h f i t c p i 双染；d ：j j l15 0 u m o l 药物培养4 8 h f i t c p i 双染 五、g a 对k 5 6 2 细胞相关凋亡蛋白的影响 w e s t e r nb l o t 结果显示加入g a 组s u r v i v i n 蛋白较不加药组降低，p 3 8 蛋白较 不加药组升高。见图6 1 5 p 3 8 s u r v i v in p a c t i n 图6 ，g a 对k 5 6 2 细胞p 3 8 及s u r v i v i n 蛋白的影响 g a 能上调k 5 6 2 细胞中p 3 8 蛋白的表达；与空白对照组相比，g a 组积分光度 值有较明显的上升，差异均具有统计学意义( p c 2 m y e ，这些原癌基因的上调参与甘草诱 导细胞凋亡的调控1 7 1 8 1 。 2 、改变胞内钙浓度 胞内钙升高是重要的细胞凋亡启动信号，参与多个不同的细胞凋亡模型的调 控，甚至发挥决定性的作用【19 1 。细胞凋亡中钙信号的产生有两种不同方式。即依 赖胞# b c a 2 + 的内流和依赖胞内c a 2 + 的重新分布。有报道甘草提取物诱导凋亡 敏感肿瘤细胞株m g c 2 8 0 3 ，h e p g 2 ，n s c l c 和不敏感株b g c 2 8 2 3 凋亡，g a 等 甘草提取物诱导m g c 2 8 0 3 细胞凋亡的调控机理与胞内钙池排空诱导# t c a 2 + 内 流有关【1 扪。 3 、线粒体与凋亡 凋亡过程中线粒体的早期改变是膜通透性变化和转膜电位( m i t o c h o n d r i a l t r a n s m e m b r a n ep o t e n t i a l ) 降低，线粒体膜间孔大小及转膜电位调节细胞凋亡【2 0 】。 实验表明，m g c 2 8 0 3 ，h e p g 2 ，n s c l c 和b g c 2 8 2 3 经g a 等甘草提取物作用后， 线粒体膜电位急剧下降，并长时间维持下降趋势。进一步观察到胃癌m g c 2 8 0 3 、 肝癌h e p g 2 、肺癌n s c l c 与宫颈癌h e l a 细胞经g a 等甘草提取物作用后发现凋亡 细胞形态变化特征，凋亡不敏感细胞株b g c 2 8 2 3 经甘草提取物作用后生长明显受 到抑制1 8 】。胞内游离钙升高和线粒体膜电位降低很可能是甘草提取物诱导细胞凋 亡的上游事件。 ( 三) 抑制r a s 系统 肾素血管紧张素系统( r a s ) 通过自分泌和或旁分泌在局部发挥效应。a n g l i 是r a s 中的主要生物活性成分，通过位于靶组织上的a t1 r ，a t2 r 介导其生物 学作用。a n g l i 与a t l 受体结合可促进细胞分裂增殖，与a t 2 受体结合后则最终 起到抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，促进细胞分化的作用。g a 对k 5 6 2 细胞的抑制 作用呈浓度、时间依赖性。g a 浓度与培养液上清液中a n 甜i 含量的存在正相关性， 这一结果与张风云的g a 可以阻断a n g l i 与a tr 结合的研究结果相一致【2 1 1 ， g a 可阻断白血病细胞自身分泌的a m g l i 与该细胞表面的a t lr 的结合，转而与a t 2r 结合。g a 具有抗白血病细胞增殖的活性，可能通过抑锋j i j a n g l i 与at 1r 结合，从 而阻断a t r 介导的促进白血病细胞增殖的作用【2 2 1 。 ( 四) 抑制肿瘤细胞侵袭 a l b i n i 等人用天然基底膜胶重建基底膜的模型【2 3 1 进行肿瘤细胞侵袭定量实验 发现1 8 1 3 甘草次酸等有抑常i p g c l 3 细胞侵袭的作用。1 8 1 3 甘草次酸可降低 p g c l 3 细胞增殖能力并呈剂量依赖性，同时抑匍j p g c l 3 细胞的侵袭能力( p 0 、 1 0 1 ) 且有剂量依赖性。这些药物抗侵袭作用的机理包括对癌细胞侵袭的三个基本 环节粘附、运动和降解能力的抑制，而不是对某一环节的阻断作用【2 4 】。 明胶酶( g e l a t i n a s e ) 是基质金属蛋白酶( m a t r i x m e t a l l o pr o t e i n a s e ，m m p s ) 中的 重要成员，大量研究表明，明胶酶a 、明胶酶b 参与恶性肿瘤的浸润行为，有研究 发现g a 具有抗白血病细胞侵袭的能力，可能是通过抑制明胶酶a 、b 的活性从而 抑制了肿瘤细胞的侵袭能力而发挥作用。为白血病细胞髓外浸润的预防提供实验 依据【2 5 1 。 g a 在我国资源丰富，成本低廉、对人体不良反应轻微，可望成为一种低毒高 效的抗肿瘤的新型药物。它通过多种机制抑制肿瘤细胞，促进其凋亡，诱导分化。 细胞分化异常是癌细胞最本质的特征，癌细胞的侵袭行为是细胞分化异常的一种 表现，可以通过诱导细胞分化来抑制癌细胞的侵袭。细胞分化可通过细胞因子调 控，通过细胞周期调节，酶的调节，使细胞周期蛋白、明胶酶活性等发生变化。 细胞凋亡通过抑制原癌基因激活，增强抑癌基因活性，启动多种凋亡途径，进而 使线粒体内膜通透性改变，细胞钙离子紊乱，启动c a p s e 连锁反应，诱导细胞凋 亡。细胞凋亡和分化是相互联系的，各机制之间是否存在紧密的机制网络以及网 络的联结尚需进一步研究。 参考文献 1 国家医药管理局中草药情报中心站植物药有效成分手册【m 】北京：人民卫生出版社， 1 9 8 6 5 1 0 - 6 7 2 2 陈晓光，韩锐甘草次酸对苯并芘诱发d n a 损伤及非程序d n a 合成的影响【j 】药学报 告，19 9 4 ，2 9 ( 10 ) ：7 2 5 7 2 9 3 左风甘草甜素及其非对映异构体对人体肿瘤细胞生长的抑制作用【j 】国外医学中医中药 分册，19 9 9 ，21 ( 5 ) ：4 0 - 4 5 4p e t e rm ，h e r s k o w i t zi1 j o i n i n gt h ec o m p l e x ：c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r yp r o t e i n sa n d t h ec e l lc y e l e j c e l l ，19 9 4 ，7 9 ( 2 ) ：181 - 18 4 5h i r a m afk o e f f l e rhp 1r o l eo ft h ec y c l i n 2 , d e p e n d e n tk i n a s e i n h i b i t o r si nt h ed e v e l o p m e n to f c a r l c e ri f b l o o d ，1 9 9 5 ，8 6 ：8 4 1 - 8 5 4 6m e h t akm c q u e e nt ，n e a m m in ，e t a a c t i v a t i o no fr e t i n o i dr e c e p t o r sr a r a a n dr x r a i n d u c e sd i f f e r e n t i a t i o na n da p o p t o s i s ，r e s p e c t i v e l y ，i nh e l a 6 0c e l l s j c e l lg r o w t hd i f f e r , 1 9 9 6 ，7 ( 4 ) ：1 7 9 - 1 8 6 7s h a oz m ，d a w s o nm i ，l i x s ，e t a l p 5 3i n d e p e n d e n tg o ( 31a r r e s ta n da p o p t o s i si n d u c e db ya n o v e lr e t i n o i d i nh u m a nb r e a s tc a n c e rc e l l s j o n c o g e n e ，19 9 5 ，i1 ( 2 ) ：4 9 3 5 0 4 8o h t s u b om ，t h e o d o 粥am ，s c h u m a c h e rj ，e ta 1 h u m a n c y c l i ne ，an u c l e a rp r o t e i n e s s e n t i a lf o rt h eg 1t osp h a s e t r a n s i t i o n 【j m o lc e l lb i o l ，1 9 9 5 ，1 5 ( 5 ) ：2 6 1 2 2 6 2 4 9 柯文娟，刘新月，陈燕，舒文秀，甘草次酸对k 5 6 2 细胞增殖抑制作用及其机制研究，中国 传统中草药，2 0 0 8 5 ( 3 9 ) ：7 1 4 7 1 7 1 0 黄炜，黄济群，张东方，等1 8 1 3 一甘草次酸和甘草酸对人肝癌细胞增殖的抑制和诱导分化作 用中国中医药科技2 0 0 2 ；9 ( 2 ) ：9 2 9 6 11h i b a s a r n ih ，1 w a s eh ，y o s h i o k ak ，e t a l g l y c y r r h e t i ca c i da m e t a b o l i cs u b s t a n c ea n da g l y c o n o fg l y e y r r h i z i n ) i n d u c e sa p o p t o si si nh u m a nh e p a t o m a , p r o m y e l o t i cl e u k e m i aa n d 12a b eh ，o h y an ，y a m a m o t okf ，e t a l e f f e c t so fg l y c y r r h i z i na n dg l y c y r r h e t i n i ca c i do n g r o w t ha n dm e l a n o g e n e si si nc u l t u r e db 16 m e l a n o m ac e l l s 【j 】e u rjc a n c e rc l i no n c o l ，19 8 7 ， 2 3 ( 1 0 ) ：1 5 4 9 - 1 5 5 5 13l e eh y ，c h u n gh y ，k i mk i d ，e t a 1 n d u c t i o no fd i f f e r e n t i m i o ni nt h ec u l t u r e df 9 t e r a t o c a r c i n o m as t e mc e l l sb yl r i t e r p e n ea c i d s jc a n c e rr e sc l i n o n c o l19 9 4 ；12 0 ( 9 ) ：513 516 14o k a m o t ot t h ep r o t e