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胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价中文摘要 中文摘要 家蚕茧脱胶后可以获得一种生物相容性良好的高分子蛋白纤维丝素。这种 丝素纤维可溶解在高浓度的中性盐如氯化钙和乙醇水溶液三元系统中，经过透析 脱盐处理后可获得水溶性的再生液态丝素。改变蚕丝脱胶和丝素溶解的条件就可 以制成分子量范围分布不同的丝素肽混合物( 1 0 2 0 0 k d a ) 。当将这种再生液态丝 素迅速引入到能与水混溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇或丙酮中，丝素蛋白因快 速失水、变性而引起其结构d 化，就生成乳白色的丝素微粒。经过有机溶剂的分离 就可以制成粒径分布在4 0 - - 1 2 01 1 1 1 1 范围内丝素纳米颗粒。这种结晶性的丝素纳米颗 粒不溶于水，但经过超声处理能良好分散在水溶液中。应用戊二醛为交联剂，通 过丝素纳米颗粒表面存在的氨基将治疗糖尿病的常用多肽药物胰岛素固定在丝 素纳米颗粒表面，制成固定化胰岛素的丝素纳米颗粒或称之为胰岛素丝素纳米颗 粒生物结合物( 简称i n s s f n s ) 。本实验应用酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 对i n s s f n s 生物结合物的体外特性作了系统分析，探讨了这种生物结合物的最佳制备工艺或 条件。当戊二醛浓度为0 7 、丝素纳米颗粒与多肽药物之比为1 5 ：3 0 ( m g i u ) 情 况下，4 交联8 h 可获得较好的最佳修饰效果，其回收率可达n 9 0 1 2 0 。当胰岛 素与丝素纳米颗粒表面氨基共价结合后，其生物结合物的热稳定性以及对胰蛋白 酶消化的抵抗力都有较大提高；i m - s f n s 在血清中的体外半衰期也明显高于自然胰 岛素( 2 5 倍) 。对流免疫电泳分析表明i n s s f n s 在兔体内无免疫原性。体内活性试 验表明，i n s s f n s 在四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠体内降血糖的活性比未修饰的 自然胰岛素长8 倍左右。上述实验结果充分表明，胰岛素与丝素纳米颗粒生物结合 后，其在体外和体内的生物稳定性明显提高。实验结果显示利用蚕丝蛋白制成的 丝素纳米颗粒，不仅是酶修饰或固定化的优良载体，也是多肽药物良好的缓释载 体。今后，很有必要在动物体内进行药理学、毒理学等方面的深入研究与探索。 关键词：丝素纳米颗粒、胰岛素、生物结合、e l i s a 、交联 作者：阎海波 指导老师：张雨青( 研究员) 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 a b s t r a c t b i o s y n t h e s i so f i n s u l i n - - s i l kf i b r o i nn a n o p a r t i c l e sc o n j u g a t e s a n de v a l u a t i o no fad r u gd e l i v e r ys y s t e m a b s t r a c t s i l kf i b m i nd e r i v e df r o m 肋m b y xm o r ii sab i o m a c r o m o l e c u l a rp r o t e i nw i t h o u t s t a n d i n gb i o c o m p a t i b i l i t y w h e ni tw a sd i s s o l v e di nh i g h l yc o n c e n t r a t e dc a c h s o l u t i o n a n dt h e nt h em i x t u r eo ft h ep r o t e i na n ds a l tw a ss u b j e c t e dt od e s a l t i n gt r e a t m e n t sf o rl o n g t i m ei nf l o w i n gw a t e r , t h er e s u l t i n gl i q u i ds i l kw a sw a t e r - s o l u b l ep o l y p e p t i d e sw i t hd i f f e r e n t m o l e c u l a rm a s s e s ，r a n g i n gf r o m10t o2 0 0k d a w h e nt h el i q u i ds i l kw e r ei n t r o d u c e d r a p i d l yi n t oa c e t o n e , s i l kp r o t e i nn a n o p a r t i c l e sw i t har a n g eo f4 0 - 1 2 0n mi nd i a m e t e r c o u l db eo b t a i n e d t h ec r y s t a l l i n es i l kn a n o p a r t i c l e sc o u l db ec o n j u g a t e dc o v a l e n t l yw i t h i n s u l i na l o n ew i t h c r o s s - l i n k i n gr e a g e n tg l u t a r a l d e h y d e n v i t r o p r o p e r t i e s o ft h e i n s u l i n - s i l kf i b r o i n n a n o p a r t i c l e s0 n s s n db i o c o n j u g a t e s w e r ed e t e r m i n e d b y e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) t h eo p t i m a l c o n d i t i o n s f o rt h e b i o s y n t h e s i so fi n s - s f nb i o c o n j u g a t e sw e r ei n v e s t i g a t e d i n s - s f nc o n s t r u c t so b t a i n e db y 8 ho fc o v a l e n tc r o s s f i n - k i n gt i m ea tt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so f0 7 c r o s s - l i n k i n g r e a g e n t , 4 a n dt h ep r o p o r t i o no fi n s u l i na n ds f n ( 3 0 ：15 ，i u m g ) s h o w e dm u c hh i g h e r r e c o v e r i e sf r o m9 0 - - 12 0 w h e ni n s u l i nw a sc o u p l e dc o v a l e n t l yw i t hs i l kn a n o p a r t i c l e s ， t h et h e r m o s t a b i l i t ya n dr e s i s t a n c eo ft h em o d i f i e di n s u l i nt ot r y p s i nd i g e s t i o na n di nv i t r o s t a b i l i t yi nh u m a ns i 朗砌mw e r eg r e a t l ye n h a n c e da sc o m p a r e dw i t hi n s u l i na l o n e t h er e s u l t s i nh u m a ns e r u mi n d i c a t e dt h a tt h eh a l f - l i f e nv i t r oo ft h eb i o s y n t h e s i z e di n s s f n d e r i v a t i v e sw a sa b o u t2 5t i m e sm o r et h a nt h a to fn a t i v ei n s u l i n a c t i v i t y nv i v ot e s t s s h o w st h a ti n d u c e db ya l l o x a nd i a b e t e sm o d e lr a t si n s s f n si nv i v oh y p o g l y c e m i e a c t i v i t ya b o u t8t i m e sm o r et h a nt h a to ff r e ei n s u l i n t h e r e f o r e ，t h es i l kp r o t e i n n a n o p a r t i c l e sh a v et h ep o t e n t i a lv a l u e s o fb e i n gs t u d i e da n dd e v e l o p e da san e w b i o c o n j u g a t ef o re n z y m e p o l y p e p t i d ed r u gd e l i v e r ys y s t e m k e y w o r d s ：s i l k - f i b r o i nn a n o p a r t i c l e s ，i n s u l i n ，b i o c o n j u g a t i o n ，e l i s a ，c r o s s - l i n k i n g w r i t t e nb yy a nh a i b o s u p e r v i s e db yz h a n gy u q i n g n 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：返渔苎壅 。日期：丝：z ：z 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：! 洫垒日期：垒：i ：f 导师签名：越日期：型牡7 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价前言 上- j - - 刖吾 糖尿病作为一种严重的病患已广为人知，是目前世界范围内的一种流行病。 伴随着寿命的延长和生活水平的进一步提高，糖尿病将成为2 1 世纪对人类健康危 害的主要疾病之一。 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是由胰岛p 细胞分泌的。胰岛素是 第一个发现并用于治疗糖尿病的药用多肽，1 9 2 2 年胰岛素用于治疗糖尿病；1 9 2 3 年，已经可以生产高效的、纯化的胰岛素；1 9 2 5 年以前，拯救生命的胰岛素已经 改变了当时3 0 0 0 0 多糖尿病患者的生活；此后8 0 多年来，随着生物技术的发展， 药用胰岛素的纯度得到不断提高，对胰岛素治疗糖尿病的给药方式也进行了许多 研究，从最初的注射给药到口服、透皮渗透、肺部吸收、埋植等等，几乎所有可 能的治疗途径都尝试过，但无论治疗方案及其制备方式有多大的进步，皮下注射 仍是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病唯一切实可行的方法【l j 。胰岛素能抑制肝脏中葡 萄糖的生成，增加周围组织对葡萄糖的利用，使血糖降低。它还抑制脂肪分解， 阻止酮体生成。胰岛素与其它许多多肽类药物一样，对酸、碱、热和酶等很敏感， 口服或其它非注射途径给药后，其生物利用度明显降低以致失效。另外，一日数 次的长期注射令患者痛苦不堪，并伴有多种并发症，因而国内外研究人员对胰岛 素缓释或长效注射剂的研究热情不减，其焦点之一就是对胰岛素进行修饰或生物 连接以延长其体内作用时间。 丝蛋白是由家蚕( b o m b y xm o r i ) 生产的天然高分子蛋白，由丝素和丝胶两种 蛋白组成，其中占主要部分的是丝素蛋白，分子量高达3 7 0k d a ，极性侧链氨基酸 含量丰富，对人体无免疫、无毒害，具有良好的生物相容性。丝素再生以后也具 有良好的可塑性，是酶和药用蛋白的良好修饰物，其独特的化学结构，经适当的 处理，可在无规则卷曲和0 l 螺旋结构与d 折叠结构之间相互转变，外观也可相应 地呈现为纤维状、溶液状、颗粒状、凝胶状、膜状等。当水溶性再生丝素通过戊 二醛的交联与酶连接后可以作为缓释的注射剂，但美中不足的是这种载体仍是一 种水溶性蛋白，在体内会受到各种蛋白酶侵袭，易被分解【z j 。作为酶、多肽或药物 缓释载体的纳米颗粒具有良好的生物相容性，较大的比表面积，较小的颗粒直径， 易于在其表面偶联一些特异性的配体，调控酶的结构和功能，是一种新型的药物 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 前言 缓释制剂，可增强药物的稳定性，减轻药物毒副作用，延长药物的作用时间，从 而提高药物疗效。为了解决水溶性再生丝素所存在的问题，本实验室最近发明了 一种新技术，能将再生丝素制成纳米级的结晶性丝素颗粒【3 l 。研究表明这种丝素纳 米颗粒平均粒径约8 0 砌，呈球形，为1 3 折叠构造，表面与许多活性基团如氨基 和羟基等存在，可用于酶或多肽药物的连接或修饰。 因此，基于以上理论和实践基础，针对胰岛素的修饰特点及技术难题，重点 是：( 1 ) 延长修饰胰岛素在体外和体内的作用时间；( 2 ) 尽可能的保持胰岛素的 活力；( 3 ) 尽量使用少的修饰载体。本文主要利用蚕丝蛋白，首先制备多种丝素 纳米颗粒。然后以丝素纳米颗粒为载体，应用戊二醛为交联剂，将胰岛素连接在 丝素纳米颗粒表面的氨基上，制成胰岛素丝素纳米颗粒生物结合物。应用e l i s a 方法对这种多肽丝素纳米颗粒结合物的体外活性作了系统研究和分析，并探讨了 这种生物结合物制备的最佳条件。同时，应用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，进 行体内降血糖的活性试验。通过对丝素纳米颗粒作为多肽药物载体较为系统的评 价，为今后丝素纳米颗粒作为酶多肽药物缓释载体的深入研究与开发打下了良好 基础。 2 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 第一章文献综述 糖尿病的病因目前认为是由于胰岛素分泌、胰岛素作用或两者同时存在缺陷 所引起的碳水化合物、蛋白质、电解质及脂肪代谢紊乱，从而使肝、肌糖原不能 合成的一种综合症，以血糖增高为基本特征。它是二种常见的内分泌代谢病，需 要终身治疗，治疗的最终目标是使血糖正常化、纠正代谢紊乱。全世界目前有2 3 亿糖尿病患者，预计2 0 2 5 年将升至3 3 亿。我国现有糖尿病患者已达4 0 0 0 万，其 中9 0 9 5 为i i 型糖尿病，糖尿病已成为我国继肿瘤、心脑血管疾病之后的第3 位 严重的慢性非传染性疾病【4 】，成为越来越严峻的公共卫生问题，是近年我国发病 率急剧升高的主要疾患【5 】【6 】。在1 9 7 9 年全国1 4 省市糖尿病研究协作组报告中北京 地区发病率为1 1 0 ，1 9 9 4 年全国1 9 省市报告中北京地区发病率为3 3 4 ，1 0 年 后发病率上升约3 倍。因此，糖尿病的诊断和治疗是全世界生物医学工程界面临 的重大课题。 糖尿病的类型大致分为：i 型糖尿病、i i 型糖尿病、特异性糖尿病和g d m 。 i 型糖尿病是胰岛b 细胞破坏导致胰岛素缺乏而引起糖尿病。分为自身免疫性和特 发性两个亚型。i i 型糖尿病是胰岛素抵抗为主而伴有胰岛素分泌不足或胰岛素分 泌不足为主而伴有胰岛素抵抗。此种类型糖尿病确切的病因及发病机制至今尚不 清楚，大多数患者有肥胖，无肥胖的患者有腹部脂肪分布增加，血胰岛素水平正 常或升高。随着体重下降及药物治疗，胰岛素抵抗性可改善。特异性糖尿病是本 病与以下因素有关：1 、胰岛p 细胞功能基因异常；2 、胰岛素作用的基因异常；3 、 胰腺外分泌疾病；4 、内分泌疾病；5 、药物或化学制剂所致；6 、感染；7 、少见 型免疫介导的糖尿病；8 、其他遗传性疾病有时伴有糖尿病。g d m 为妊振期间发生 或发现的糖尿病。 要有效地治疗糖尿病，必须要先明确糖尿病的治疗目标，从而选择正确的治 疗方法，达到理想的治疗效果。国家糖尿病服务机构把减少并发症作为首要目标， 其次还有以下几个方面：1 、纠正高血糖和高血脂等代谢紊乱，促使糖、蛋白质和 脂肪的正常代谢；2 、缓解高血糖等代谢紊乱所引起的症状；3 、防治酮症酸中毒 等急性并发症和防治心血管、肾脏、眼睛及神经系统等慢性病变，延长患者寿命， 降低病死率；4 、肥胖者应积极减肥，维持正常体重。糖尿病的基本治疗方案包括 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育5 个方面。这5 方面是 互为结合互为补充的。 胰岛素仍是治疗胰岛素依赖型糖尿病的唯一药物，对胰岛素缺乏的各型糖尿 病均有效，科学家们不断努力探索新的治疗途径和方法。近年来，随着基因重组 技术及转基因技术迅速发展，学者们开始利用基因工程再造分泌胰岛素的克隆细 胞来替代胰岛细胞，而胰岛移植治疗是一种更接近生理方式的有效方法，可实现 对血糖的持续监测和精细调节。另外，有学者成功地利用小鼠胚胎干细胞体外培 养出产生胰岛素的胰岛组织，并发现该组织可使链脲佐菌素( s t z ) 诱导的糖尿病小 鼠血糖恢复正常，这表明用干细胞治疗糖尿病具有巨大潜力，这些为i 型糖尿病 治疗提供了新途径。糖尿病i i 型的治疗措施有许多种，其基本作用机制是针对疾 病的基本病理生理。目前，i i 型糖尿病的治疗仍然是以降低血糖水平及减轻症状 为主要目标，其中少部分( 约1 5 ) 在早期阶段通过饮食、运动和减轻体重等疗法可 以控制病情。治疗i i 型糖尿病的口服降糖药，按其作用机制大致分为延缓肠道葡 萄糖吸收的0 【葡萄糖苷酶抑制剂、促进胰岛素分泌剂、影响葡萄糖代谢的双胍类 药物、增加机体对胰岛素敏感性的噻唑烷二酮类等。 1 胰岛素的组成与结构 胰岛素是第一个被阐明化学结构的蛋白质，由5 1 个氨基酸组成，存在种属差 异，人胰岛素的分子量是5 8 0 8d a 。胰岛素由2 条链组成，分别称为a 链和b 链， a 链由2 1 个氨基酸组成，b 链由3 0 个氨基酸组成。a 链和b 链之间通过两对二 硫键相连，此外a 链第6 位和1 1 位上的两个半胱氨酸通过二硫键形成链内小环。 分析比较各种哺乳动物、鸟类、鱼类等的胰岛素一级结构，发现其氨基酸排列顺 序大体相同但存在细微差异。不同种属来源的胰岛素的差异位置在于a 链小环的 第8 、9 、1 0 位和b 链的第3 0 位，说明这4 个氨基酸残基的改变并不影响胰岛素 的生物活性，换言之，这4 个氨基酸残基对胰岛素的生物活性并不起决定作用。 此外，研究发现5 1 个氨基酸中有2 2 个氨基酸是始终不变的，为不同种属来源的 胰岛素所共有。例如a 链、b 链中的6 个半胱氨酸残基的位置始终不变，这说明 不同种属来源的胰岛素分子中，a 、b 链都有共同的连接方式，三对二硫键对维持 胰岛素的高级结构起着重要作用；其他一些相同的氨基酸绝大多数属于非极性、 带有疏水侧链的氨基酸，x 射线晶体结构分析结果证明，这些非极性氨基酸对维 持胰岛素分子的高级结构起着稳定作用。从而可知，不同种属来源的胰岛素其空 4 胰岛素。丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 闻结构大体一致1 7 。 1 1 胰岛素的类型 1 1 1 按来源分类 可分为动物胰岛素和基因工程胰岛素，动物胰岛素是指以猪或牛的胰脏为原 料，用分离、提取、结晶、纯化工序，使产品达到一定的纯度。动物胰岛素的结 构与人胰岛素相比，虽均含有氨基酸，但猪、牛胰岛素分子中分别有1 、3 个氨基 酸与人胰岛素不同。基因工程胰岛素是利用生物工程技术，经非致病的酵母菌或 大肠杆菌等微生物发酵，去除杂质获得高纯度的人胰岛素，其氨基酸排列顺序及 生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。与动物胰岛素相比，人胰岛素注射后吸 收快，作用时间短，主要优点是免疫原性显著下降，体内一般不产生针对胰岛素 的抗体，生物活性有所提高。 1 1 2 按纯度分类 可分为结晶胰岛素和纯化胰岛素：结晶胰岛素是指用牛或猪的胰脏制备，经 低温冷藏后，用酒精提取的，杂质多，胰岛素含量约为7 0 。这种普通胰岛素含 有较多的蛋白水解酶、胰岛素原等杂质。蛋白水解酶具有免疫原性，并能降低胰 岛素的稳定性。纯化胰岛素为通过层析使胰岛素的纯度达到9 8 的结晶胰岛素， 因色谱图上仅呈一单峰，故又称单峰纯胰岛素。进一步将单峰胰岛素再经离子交 换树脂处理而取得更纯的胰岛素称为单组分胰岛素，纯度在9 9 以上。纯化胰岛 素比普通胰岛素有更多优点，如用药剂量减小、代谢良好、血糖控制稳定、减轻 患者痛苦等。 1 1 3 按作用时间长短分 可分为快速作用胰岛素类似物、短效胰岛素、中效胰岛素、长效胰岛素和预 混型人胰岛素。 1 1 3 1 快速作用胰岛素类似物 是一种经修饰的生物合成人胰岛素类似物，除了一个氨基酸被替换外，其他 结构与天然人胰岛素完全相同。速效胰岛素类似物与常规人胰岛素相比有以下优 点：( 1 ) 进餐前即刻注射速效胰岛素类似物控制餐后血糖波动的效果优于餐前3 0 m i n 注射常规人胰岛素；( 2 ) 速效胰岛素类似物在注射部位的吸收比较稳定，个体 内和个体间的变化较小；( 3 ) 作用时间均不超过4 h ，故发生夜间低血糖的危险性 较低；( 4 ) 餐前餐后都可以注射用药，适用于在日常生活中需要更大灵活度的患 5 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 者，或在进餐时应用胰岛素有困难的患者。缺点是价格相对较高。 1 1 3 2 短效胰岛素 皮下注射短效胰岛素主要控制餐后的高血糖。静脉注射可即刻起作用，主要 适用于：( 1 ) 急诊抢救的情况下；( 2 ) 最初应用胰岛素者；( 3 ) 消除餐后高血糖； ( 4 ) 应用胰岛素泵输注胰岛素。缺点是单用短效胰岛素空腹血糖控制欠佳。 1 1 3 3 中效胰岛素 由于胰岛素与鱼精蛋白结合形成溶解度降低的复合物而使其吸收减慢，作用 时间延长。注射后2 4 h 开始起作用，持续1 6 2 4 h ，每日皮下注射1 2 次。适用于 控制基础血糖水平、餐后血糖控制欠佳者。 1 1 3 4 长效胰岛素 包括鱼精蛋白锌胰岛素( p z i ) 和特慢胰岛素锌悬液( u l t r a l e n t e ) ，仅能皮下 注射。p z i 系由胰岛素与过量鱼精蛋白结合形成的胰岛素，并加入过量的锌使制剂 稳定而制成的长效制剂。u l t r a l e n t e 国内应用较少，该制剂是由锌和胰岛素形成的 难溶性结晶混悬于醋酸缓冲液中制成。皮下注射u l t r a l e n t e 后3 4 h 起效，可持续大 约3 6 h 。长效胰岛素每日皮下注射1 2 次。 1 1 3 5 预混型人胰岛素 目前临床上常用的剂型有短效人胰岛素和中效人胰岛素以及短效与中效各预 先混合的预混型人胰岛素，也可根据血糖情况自己配制不同比例的预混胰岛素。 该型胰岛素也仅能皮下注射，半小时起效，最大作用时间为2 8 h ，可持续2 4 h 。每 日注射1 2 次，既可控制餐后高血糖又能控制平日基础血糖水平。 1 2 胰岛素的剂型 胰岛素过去主要以注射途径给药，给长期用药的病人带来诸多不便和痛苦， 且普通胰岛素注射液存在起效慢的缺点，长效胰岛素则由于释药不稳定易产生低 血糖症状。多年来世界各国药物学家一直致力于胰岛素非注射方式新剂型的研究， 涉及的剂型品种有黏膜吸收给药制剂、滴鼻剂、滴眼剂、口服、肺部吸入给药制 剂、透皮制剂和新型注射剂等。 1 2 1 黏膜给药系统 黏膜给药有利于药物直接吸收进入血液循环，避免肝脏首过效应。蛋白质黏 膜给药的途径有口腔、鼻腔、直肠、眼部等。不同给药位点的黏膜组织生理结构 不同，淋巴毛细管分布不一，因而不同黏膜的给药剂型和给药效果差异较大。 6 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 1 2 2 肺部给药 肺部给药具有以下优点：肺部吸收表面积大( 1 0 0m m ) ，较少的蛋白降解酶 s l 9 1 ；药物经空气血液途径交换的距离短、速度快；可减轻药物的肝首过效应，提 高人体的生物利用度。蛋白质肺部给药常采用吸入方式，给药剂型为吸入气雾剂 或干粉吸入剂。杨丹波等【1 0 1 采用喷雾干燥法制备了胰岛素吸入粉雾剂，并对其吸 收促进剂在大鼠体内的药效学进行初步研究，发现压牛黄胆酸钠和去氧胆酸钠可 有效促进胰岛素干粉吸入剂的降血糖效果。 1 2 3 透皮给药 蛋白类药物经皮肤给药具有诸多优点，它可以避免胃肠道因素对药物的影响， 可延长药物的作用时间，且使用方便。但是皮肤角质层对大分子的蛋白多肽类药 物具有天然的屏障作用，必须借助一些新技术来促进其吸收。 1 2 4 口服制剂 由于一直被认为是最方便、最安全、最易被患者接受的给药方式，口服是蛋 白质非注射给药的重要途径，但口服胰岛素的生物利用度很低。不过，这种给药 方式仍将是今后国际蛋白质药物的发展前沿和热点。 1 3 胰岛素的生物学作用与调节 1 3 1 胰岛素与糖代谢的相互作用 j 胰岛素促进组织、细胞对葡萄糖的摄取和利用，加速葡萄糖合成为糖原，贮 存于肝脏和肌肉中，并抑制糖异生，促进葡萄糖转变为脂肪酸，贮存于脂肪组织， 导致血糖水平下降。胰岛素缺乏时，血糖升高，如超过肾糖阈，尿中将出现糖， 引起糖尿病。 血糖浓度是调节胰岛素分泌的最重要因素，当血糖浓度升高时，胰岛素分泌 明显增加，从而促进血糖降低；当血糖浓度下降至正常水平时，胰岛素分泌也迅 速恢复到基础水平。在持续高血糖的刺激下，胰岛素的分泌可分为三个阶段：血 糖升高5r a i n 内，胰岛素的分泌可增加约1 0 倍，主要来源于1 3 细胞贮存的激素释放， 因此持续时间不长，5 1 0m i n 后胰岛素的分泌便下降5 0 ；血糖升高1 5m i n 后， 出现胰岛素分泌的第二次增多，在2 3 h 达高峰，并持续较长的时间，分泌速率也 远大于第一相，这主要是激活y 1 3 细胞胰岛素合成酶系，促进了合成与释放；倘若 高血糖持续一周左右，胰岛素的分泌可进一步增加，这是由于长时间的高血糖刺 激p 细胞增生布引起的。 7 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 1 3 2 胰岛素与脂肪代谢的相互作用 胰岛素促进肝合成脂肪酸，然后转运到脂肪细胞贮存。在胰岛素的作用下， 脂肪细胞也能合成少量的脂肪酸。胰岛素还促进葡萄糖进入脂肪细胞，除了用于 合成脂肪酸外，还可转化为a 磷酸甘油，脂肪酸与a 磷酸甘油形成甘油三酯，贮 存于脂肪细胞中，同时，胰岛素还抑制脂肪酶的活性，减少脂肪的分解。胰岛素 缺乏时，出现脂肪代谢紊乱，脂肪分解增强，血脂升高，加速脂肪酸在肝内氧化， 生成大量酮体，由于糖氧化过程发生障碍，不能很好处理酮体，以致引起酮血症 与酸中毒。右脂肪酸和酮体大量增加时，可促进胰岛素分泌。 1 3 3 胰岛素对蛋白质代谢的调节 胰岛素促进蛋白质合成过程，其作用可在蛋白质合成的各个环节上：1 、促进 氨基酸通过膜的转运进入细胞；2 、可使细胞核的复制和转录过程加快，增加d n a 和r n a 的生成；3 、作用于核糖体，加速翻译过程，促进蛋白质合成；另外，胰 岛素还可抑制蛋白质分解和肝糖异生。由于胰岛素能增强蛋白质的合成过程，所 以，它对机体的生长也有促进作用，但胰岛素单独作用时，对生长的促进作用并 不很强，只有与生长素共同作用时，才能发挥明显的效应。 1 3 4 激素对胰岛素的调节 影响胰岛素分泌的激素主要有：l 、胃肠激素，有促胰岛素分泌的作用，但有 的是在药理剂量时才有促胰岛素分泌作用，不像是一般的生理刺激物，只有抑胃 肽( g 口) 才可能对胰岛素的分泌起调节作用；2 、生长素、皮质醇、甲状腺激素 以及胰高血糖素告示可通过升高血糖浓度而间接刺激胰岛素分泌，因此长期大剂 量应用这些激素，有可能使p 细胞衰竭而导致糖尿病；3 、胰岛d 细胞分泌的生长抑 制至少可通过旁分泌作用，抑制胰岛素和胰高血糖的分泌，而胰高血糖素也可直 接刺激d 细胞分泌胰岛素。 1 3 5 神经调节 胰岛受迷走神经与交感神经支配。刺激迷走神经，可通过乙酰胆碱作用于m 受体，直接促进胰岛素的分泌。迷走神经还可通过刺激胃肠激素释放，间接促进 胰岛素的分泌。交感神经兴奋时，则通过去甲肾上腺素作用于睨受体，抑制胰岛 素的分泌。 1 4 胰岛素治疗糖尿病的优缺点 优点：自胰岛素开发至今，胰岛素治疗发生了极大的变化：1 、胰岛素纯度不 8 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 第一章文献综述 断提高，免疫源性不断下降，单峰、单组份胰岛素在临床上广泛应用；2 、胰岛素 结构由动物到人，基因工程和成人胰岛素不仅在普及而且在不断降低费用；3 、多 种剂型的出现：短效、中效、长效；4 、给药途径多样化，常用途径有皮下、肌肉、 静脉，探索新途径有鼻、口腔、腹腔、直肠等，将胰岛素中加人新的多种乳胶、 抑肽酶和牛成胆酸钠为口服开辟了新的前景；5 、给药工具不断改进，胰岛素注射 笔、无针注射器、胰岛素泵等，迄今全世界已由数以千计病人植入胰岛素泵。胰 岛素疗法的主要并发症为低血糖，严重的低血糖反应是极其有害的，可以致命， 至少对中枢神经系统产生不良影响。控制低血糖明智的措施是减少胰岛素的用量， 使血糖达到一般控制即可。 由于它是人体一种激素，因此只要正确使用，胰岛素对人体是没有害处的。 胰岛素治疗的优越性仍然是口服降糖药无法相比的，如控制血糖能力强，毒副作 用少，普通胰岛素注射医疗药费不高等【1 1 1 。 缺点：长期频繁使用注射液也会对患者产生诸多不良反应，这给患者带来了 极大的身体、心理和经济负担，给病人长期用药带来诸多不便与痛苦，且常伴有 大量副作用发生。并且普通的胰岛素口服制剂生物利用度只有0 1 0 2 ，无临床 意义。其主要原因有以下几点：l 、胰岛素易被胃肠道内的消化酶降解；2 、胰岛 素分子量大，且分子间有很强的聚合趋势，难以透过吸收屏障；3 、存在肝脏首过 效应；4 、制备过程中的胰岛素构象问题【1 2 j 。 胰岛素结构与功能关系的研究一直吸引着人们从不同的角度进行探讨，积累 了丰富的知识。但目前常用胰岛素制剂仍存在着一些缺陷，不利于患者的血糖控 制，可能导致患者血糖波动，这主要是由皮下注射胰岛素的药理学特性所决定的。 1 5 胰岛素治疗糖尿病的发展前景 胰岛素是胰腺p 细胞分泌的一种多肽类激素，具有降血糖作用。自1 9 2 2 年开始 用于治疗糖尿病，至今已有8 0 多年的历史，从早期动物胰岛素到生物合成人胰岛 素，由普通结晶胰岛素到单组分胰岛素，直至现在的胰岛素类似物，在胰岛素的 来源、纯度、作用时间、效价及制备方法等方面获得7 q i t 大进展i i 引。这些进步大 大减少了由于杂质蛋白免疫原性所引起的并发症。胰岛素的应用给无数糖尿病患 者带来了福音，但由于胰岛素是多肽类药物，易被胃肠道蛋白酶水解破坏，因而 口服无效，所以临床多年来一直是通过注射给药。 胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，但因注射给药让许多患 9 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 第一章文献综述 者产生畏惧心理，使其作用发挥受到限制。为了减少不便和疼痛，医药界正在全 力投入研究，开发更新的胰岛素剂型及给药方式。 胰岛素笔是一种专用注射装置，将胰岛素储存于笔中，使用前调好剂量刻度， 患者注射方便自如，简化了注射过程；胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射 方式，可以自动定时定量地注射胰岛素，能较好模拟生理性胰岛素分泌，它能非 常准确地按需要注入胰岛素，更适应机体的需要，不仅可以更好地控制糖代谢， 还可以大大降低低血糖的发生；胰岛素泵血糖连接监测设备技术使人工胰岛的实 现成为可能，它在电脑的控制下随时调整剂量，按需给药，真正模拟胰岛。 以色列理工学院发明出一种全新的胰岛素纳米泵注射装置，可让糖尿病患者 简单无痛地注射胰岛素和其它药物，可大大改善糖尿病患者的日常生活【1 4 1 。由于 这种独特的系统可以传送大分子，因此可以利用它来进行胰岛素注射。这种新装 置不仅方便，而且向皮肤表层注射药物比通常所采用肌肉深层穿透效果更好。 目前，糖尿病的内科替代治疗仅为治标而非治本，不能逆转其发病过程，更 不能防止晚期严重并发症的发生。胰岛细胞移植将成千上万的有分泌胰岛素功能 的胰岛细胞植入人体中，恢复糖尿病患者胰岛素分泌能力。这种新方法在2 0 0 0 年 加拿大科学家首先完成了成人胰岛细胞移植治疗型糖尿病并获得成功。研究胰岛 细胞移植治疗糖尿病已有近3 0 年的历史。糖尿病动物模型证实胰岛细胞移植可使 血糖恢复正常，并能预防或逆转早期并发症以及糖尿病微血管病变，从而确定了 胰岛移植作为临床糖尿病治疗措施的可能性，具有很大的应用前景。 征服糖尿病仍然是一项难度很大的工作，需要付出更艰辛的劳动。从某种意 义上讲，药物降糖难，防治并发症更难。从理论上讲，病因病机尚未被彻底揭开， 一些解释并发症的理论也难以自圆其说。在糖尿病的基础实验研究方面，应密切 联系临床实践，加强有效方剂作用机理的研究；建立科学的糖尿病“证”的动物模型， 进行病症同步研究，尽可能符合临床实际、稳定可靠，适当使用国外常用的自发 性糖尿病动物模型，如k k t b 鼠、遗传型肥胖性高血糖小鼠等，深入研究糖尿病的 辨证论治规律，验证和筛选有效治则和方药，客观评价中药疗效及作用机理，避 免推测性的臆断并应积极引进国际先进的技术手段，与国际水平接轨，不断更新 药诊断与检测指标。 在认识、治疗、治愈及预防糖尿病方面，仍存在特殊的机遇，与之相应的则 是一些明显的挑战和障碍。尽管这些研究仅仅是当今糖尿病研究的一个概况，但 1 0 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 第一章文献综述 亦足以表明还有多少相关问题有待研究。如果有充足的资源投入糖尿病这一领域， 在对糖尿病日益深入的研究过程中，我们必将能更清楚地认识到糖尿病的发病机 制，从而找到更优化的治疗方案，为广大的糖尿病患者带来一个更美好的明天， 治愈糖尿病是可以实现的。经过努力，人们是可以从糖尿病这一灾难中解脱的。 2 纳米给药系统 在正常情况下蛋白质药物的生物利用度很低，为了克服蛋白酶的降解作用， 通常采用缓释载体的方法。纳米颗粒是指药物分子分散或吸附在高分子聚合物中 而形成的球形微粒，微球粒径很小。许多研究表明，采用纳米颗粒载体技术，可 有效地保护蛋白质药物不失活，并能实现缓释、控释和靶向释药目的，从而显著 地提高疗效，降低毒副作用，减少给药次数，消除药物峰谷现象。纳米给药系统 是目前在药剂学中较为广泛的研究领域，具有改善难溶性药物的口服吸收、延长 药物体内循环时间、控制药物的释放、改变药物的体内分布特征、改变药物的膜 转动机制等特征，因而倍受关注。 2 1 纳米药物的载体材料 纳米药物载体材料是用于药物输送系统的物质，它对药物的释放、分布、药 效等有很重要的影响，一般要求是性质稳定，有合适的释药速度，不影响药物的 药理作用，无毒、无刺激性，具有适宜的理化性质等。目前在胰岛素纳米药物的 相关研究中所涉及到的载体材料主要有两大类天然高分子化合物、合成的高分子 化合物。天然高分子材料是最常用的成球材料，用得比较多的有淀粉、明胶、阿 拉伯胶、海藻酸盐、壳聚糖等。这些高分子材料都价廉易得，是很有前途的一类 微球载体材料。 自1 9 8 4 年证实用聚乳酸微粒作为微球载体材料的可能性后，可生物降解并可 生物吸收的合成高分子材料受到普遍重视和广泛应用，其特点是无毒、成膜及成 球性好、化学稳定性高。近十多年来，较多采用聚乳酸和乳酸羟基乙酸共聚物作 为基质材料，其体内降解机制是水解过程，最终产物是h 2 0 和c 0 2 。非生物降解材 料要采用植入给药法，虽然能够达到低毒长效的目的，但当药物释放完后，需二 次手术取出这些载体材料，而且重复给药会引起体内微粒积累，这不仅给病人带 来痛苦，还增加了患者的经济负担。而用可生物降解材料作为蛋白质微球给药载 体材料则能克服上述弊端。 胰岛素一丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价第一章文献综述 2 2 载药纳米粒种类 纳米颗粒( n a n o p a r t i c l e s ，n p ) 一般是指由天然或合成的高分子材料组成、粒 径在1 1 0 0 0n m 的固态胶体微粒【1 5 】。纳米粒用作药物载体时，由于粒径小，易通 过人体最小的毛细血管，而达到在特定组织或靶位释药的目的。纳米颗粒已经被 广泛用于各个生命科学领域，例如：生物传感器、分离纯化技术、组织学研究、 临床诊断测定、药物递送系统和美容剂等领域【1 6 】【1 7 】【1 8 】。他们应用的优势包括容易 提纯和灭菌、药物寻靶概率大、活性持续释放等【1 9 】。近来，制备纳米颗粒的方法 得到很好了的发展，其中，建立在多聚体微束上的透析过滤法已经显示了如下优 势：纯一，不产生凝聚反应，粒子体积小，高产并且事绝对球形f 2 掣。用纳米材料 作为酶的载体，较传统的载体而言，具有一些显著的优点：良好的生物相容性； 较大的比表面积，能有效地提高载酶量；较小的颗粒直径，具有很小的扩散限制， 在溶液中能稳定存在；易于在其表面偶联一些特异性的配体，调控酶的结构和功 能。纳米颗粒包括以下几种类型。 2 2 1 微乳 微乳由油、水、表面活性剂和助表面活性剂等部分组成，是一种粒径在1 - 1 0 0 n m 之间的液滴分散在另一种液体中形成的热力学稳定的胶体分散系统。微乳可使 成核、生长、聚结、团聚等过程局限在一个微小的球形液滴内，从而可形成球形 纳米颗粒，又避免了颗粒之间进一步团聚【2 1 】【2 2 】【2 3 1 。微乳所具有的高扩散性和皮肤 渗透性，使其在透皮吸收制剂的研究方面受到极大关注。 2 2 2 纳米脂质体 粒径控制在1 0 0l i r a 左右并用亲水性材料如聚乙二醇进行表面修饰的纳米脂质 体在静脉注射后兼具“长循环”和“隐形 或“立体稳定 的特点。纳米脂质体 可作为改善生物大分子药物的口服吸收以及其他给药途径吸收的载体，以脂质体 为载体主要是通过肠道细胞膜的融合或表面吸附来释放胰岛素。 2 2 3 固体脂质纳米粒 固体脂质纳米粒是近十几年才发展起来的一种新型纳米载药系统，它是以固 态的天然或合成的类脂为载体，将药物包裹于类脂核中制成粒径约为5 0 - - - 1 0 0 0r i m 的载药系统。固体脂质纳米粒的显著特点是：1 、采用生理相溶性好的低毒类脂材 料为载体；2 、制备方法成熟；3 、具有控释、靶向特性；4 、载药量较高；5 、可 改善药物稳定性。 1 2 胰岛素丝素纳米颗粒结合物的生物合成及作为药物缓释系统的评价 第一章文献综述 2 2 4 纳米囊和纳米球 主要由聚乳酸、聚丙交酯乙交酯、壳聚糖和明胶等能够生物降解的高分子材 料制备，可用于包裹亲水性或疏水性药物。不同材料的性能适合于不同的给药途 径，口服给药的纳米囊和纳米球也可用非降解性材料。 随着纳米技术的飞速发展，将纳米颗粒制备技术引入药物载体应用领域逐渐 成为人们的研究热点【2 4 】f 2 5 】【2 6 】。1 9 8 9 年，文献【2 7 】作者首次报道了离子交联法用于制 备c s 纳米粒的实验研究。这种方法在c s 纳米粒的制备中广泛应用。c a l v o ，袁弘等 【2 8 】【2 9 】制备粒径为2 0 0 , - - - , 4 0 0n l t l 的亲水性壳聚糖纳米粒，可作为蛋白质药物的一种新 型缓控释载体。但目前制备的蛋白质壳聚糖纳米颗粒的粒径大多在1 0 0n n l 以上 阱】【2 5 】【2 6 】f 2 7 】【2 8 1 2 9 ，而载药纳米颗粒在体内的吸收利用与其尺寸有一定关系，粒径越 小越能促进药物的有效吸收利用【3 0 】。2 0 0 3 年，k w a n gy o n gc h o 【3 1 峙艮道了自组丝胶 纳米颗粒的制备，他们运用丝胶蛋白和活化的p e g 反应获得自组丝胶纳米颗粒，测 得直径大小为2 0 0 , 4 0 0n n 2 。最近，张雨青等【3 】报道了一种将丝素蛋白制成平均粒度 8 0n n l 的结晶性球形纳米颗粒的新方法。用这种方法制备的纳米颗粒表面存在许多 可用于酶、多肽或药物连接的活性基团。这种纳米丝素颗粒与第三代p e g 球形载体 和交联的清蛋白纳米颗粒十分相象。所以，利用这种丝素颗粒作为酶修饰的载体 进行研究很有意义。再加上其实验室在丝蛋白的制备工艺、以丝蛋白为载体的固 定化酶研究及其酶动力学性能分析等方面已形成比较成熟的技术体系，在以再生 液体丝素或丝胶颗粒作为酶或多肽载体进行酶或多肽固定化或修饰方面的研究已 有较为系统的报道【3 2 】【3 3 】【3 4 】【3 5 1 。 2 2 5 聚合物胶束 这是近几年正在发展的一类新型的纳米载体，它同时具有亲水性基团及疏水 性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束，并完成对药物的增溶和包裹。它具 有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，且可使药物能逃避单 核巨噬细胞的吞噬，即具有“隐形”性。 2 3 纳米颗粒作为酶的缓释载体的连接方法 2 3 1 吸附法