（特种经济动物饲养专业论文）利用mrjps+vntr分子标记研究中蜂亚家系及蜜蜂属内的分子进化.pdf

作者姓名选飞墓 指导教师楼猩宣塾援 菱松塑副塾援 学科( 专业)挂登经进麴塑鱼差 专业学位名称签登经进动堑塑差 培养院系动塑型堂堂随 提交论文日期至q q 鱼生! q 旦 中国杭州 i d e n t i f i c a t i o no f p a t r i l i n e si na p sc e r a n a c e r a n ac o l o n ya n dm o l e c u l a re v o l u t i o n r e s e a r c hi na p sg e n u sb a s e do nm r j p s v n t rm o l e c u l a rm a r k e r s b v ， s h e nf e i y i n g s u p e r v i s o r ：p r o f d r l o uc h e n f u d r s us o n g k u n ad i s s e r t a t i o n s u b m i t t e da sp a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo fm s c w i t hm a j o ri ns p e c i a le c o n o m i c a n i m a lk e e p i n g i n z h e j i a n gu n i v e r s i t y o c t o b e r ，2 0 0 6 h a n g z h o u ，c h i n a 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权迸江盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 摘要 摘要 蜂王浆( r o y a lj e l l y , 简称r j ) 是哺育蜂分泌的供蜂王和三日龄以内的蜜蜂 幼虫食用的浆状物质，它对蜜蜂的级型分化起决定作用。蜂王浆主要由工蜂头 部的咽下腺和上颚腺合成、分泌。蜂王浆的化学成分因季节和区域的不同而有 所不同，蛋白质是蜂王浆的最主要组分，约占王浆干物质的5 0 ，王浆蛋白由 水溶性蛋白( w s p s ) 和非水溶性蛋白组成。其中水溶性蛋白占总蛋白含量的 4 6 0 0 - - 8 9 ，为王浆蛋白的主要部分，称为m r j p s ( m a j o rr o y a lj e l l yp r o t e i n s ) 。 至今为止，在西方蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 中已发现m r j p s 蛋白家族共有8 个成 员a m m r j p l 8 ，它们的基因序列己完成全部测序，为同一基因家族。在东方蜜 蜂( 么p i sc e r a n a ) 中，m r j p 2 、m r j p 3 和m r j p 5 的e d n a 序列c 端均存在明显 的串联重复序列长度多态性( v n t r ) ，而西方蜜蜂m r j p 2 基因e d n a 序列c 端没有发现v n t r 结构，只有m r j p 3 和m r j p 5 的c d n a 序列c 端存在明显的 v n t r 结构。 利用中蜂m r j p 2 、3 、5 三个基因的e d n a 序列c 端的v n t r 结构特点，分别 设计三对p c r 弓i 物，通过p c r 扩增和琼脂糖凝胶电泳，产生容易分辨的、多态性 高的d n a 片段，采用b i o l m a g i n gs y s t e m so fl a b w o r k s t mi m a g ea c q u i s i t i o na n d a n a l y s i ss o f t e r w a r e ( v e r s i o n4 0 ) 分析软件对多态片段进行分析判读，获得中 蜂个体的v n t r 分子标记信息，根据v n t r 分子标记鉴定蜂群中的不同亚家系。 本研究对同一中蜂蜂群的4 5 只工蜂进行三个v n r t 基因位点的检测，结果表明， 用单一的a c c m r j p 2 、3 和5 的v n t r 分子标记分别从4 5 只工蜂中鉴定出6 、1 0 和1 2 个亚家系，用这三个基因位点联合鉴定，可以从4 5 个个体中鉴定至1 j 3 7 个亚家系。 这是首次利用分子标记研究中华蜜蜂蜂群内的亚家系。 在我国境内分布的蜜蜂属( 彳p 括) 下的种主要包括东方蜜蜂、西方蜜蜂、大 蜜蜂( a p e sd o r s a t a ) 、小蜜蜂( 彳p 捃f l o r e a ) 、黑大蜜蜂( a p e sl a b o r i o s a ) 和黑小 蜜蜂( a p e sa n d r e n i f o r m i s ) 六个种，但至今还未见到利用分子生物学的手段来研 究我国境内这六个蜂种之间的亲缘关系的报道。序列分析表明在东方蜜蜂的 m r j p 2e d n a 序列的c 端存在明显的重复序列长度多态性，而西方蜜蜂在此基 因位点无明显的重复序列长度多态性。本研究克隆并测定了中蜂、意蜂、大蜜 i i a m m r j p sh a dd o n e ，a n dt h e yb e l o n gt ot h es a l t l ef a m i l y i na p i sc e r a n a ，t h e c - t e r m i n a lo ft h ee d n as e q u e n c eo ft h em r j p 2 、m r j p 3a n dm r j p 5h a v ee v i d e n t v a r i a b l en u m b e rt a n d e mr e p e a t s ( v n t r ) b u ti na p i sm e l l i f e r a ，t h ec - t e r m i n a lo f t h ec d n as e q u e n c eo ft h em r j p 2h a sn ov n t r ，a n dt h eo t h e rt w oa l s oh a v et h e v n t rs t r u c t u r e t h ek n o w l e d g eo nt h ep a t r i l i n e sa n dm o l e c u l a rg e n e t i co fa p sc e r a n ai sv e r y s h o r t i nt h i sp a p e r , w eu s et h r e ep a i r so fs p e c i f i cp r i m e r s ( p 21a n dp 2 2 ，p 31a n dp 3 2 ， p 51a n dp 5 2 ，r e s p e c t i v e l y ) ，w h i c ha r ed e s i g n e df r o ms e q u e n c e so fa p i sc e r a n a m r j p 2 ，3a n d5 ，t od e t e r m i n ew o r k e r sg e n o t y p e sa n dp a t r i l i n e si na p sc e r a n ac e r a n a c o l o n y t h e s ev n t rp r o d u c e sd i s t i n c ta n dh i 曲l yv a r i a b l ed n ap r o d u c t si nt h ep c r r e a c t i o n s t h eo b t a i n e dd n af r a g m e n t sh a v es h m c i e n ts i z ed i f f e r e n c e st ob e d i s t i n g u i s h e di n2 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i se a s i l y w ea d o p tt h eb i o i m a g i n g s y s t e m so fl a b w o r k s t mi m a g ea c q u i s i t i o na n da n a l y s i ss o f t e r w a r e ( v e r s i o n4 0 ) t o r e a dt h ep o l y r n o r p h i cf r a g m e n t st oo b t a i nt h ei n d i v i d u a lv n t rm o l e c u l em a r k e r i n f o r m a t i o n si n 和捃c e r a n ac e r a n a i nt h i ss t u d y , w eu s et h ec o m b i n a t i o no ft h r e e v n t rm o l e c u l a rm a r k e r st od e t e r m i n et h ep a t r i l i n e si n 么p 括c e r a n ac o l o n i e s 6 ，10 ， 12p a t r i l i n e sw e r ed i s c r i m i n a t e di n4 5w o r k e r sf r o mo n ea p e sc e r a n ac o l o n yu s i n g m r j p 2 ，3 ，5v n t rm a r k e r s ，r e s p e c t i v e l y w i t ht h ec o m b i n a t i o no ft h e s et h r e el o c i ，3 7 p a r t r i l i n e sw e r ei d e n t i f i e di n t h i sa p i sc e r a n ac o l o n y t h i sm e t h o di sa v a i l a b l et o i i i a b s t r a c t i d e n t i f yp a t r i l i n e si na p e sc e r a n ah o n e y b e ec o l o n yf i r s t l y t h e r ea r es i xs p e c i e so fa p i s ，i n c l u d i n g 卸i sc e r a n a ，卸i sm e l l i f e r a ，a p u d o r s a t a ，a p i s f l o r e a ，a p i sl a b o r i o s aa n da p i sa n d r e n i f o r m i s ，d i s t r i b u t ei nc h i n a a r e a s b u tu n t i ln o w ，t h e r eh a sn or e p o r to fu s i n gt h em o l e c u l a rb i o l o g ym e a n st os t u d yt h e e v o l u t i o nr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es i xs p e c i e s h e r ew ec l o n e da n dd e t e r m i n e dt h es i x s p e c i f i cc - t e r m i n a lr e p e t i t i v es e q u e n c eo ft h em r j p 2g e n eo fa e sc e r a n ac e r a n a ， a p i sm e l l i f e r a ，卸t sd o r s a t a ，a p i s f l o r e a ，a p i sl a b o r i o s aa n da p i sa n d r e n i f o r m i s ，t h e n a n a l y z e da n dc o m p a r e dt h e mw i t he a c ho t h e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e q u e n c e s o ft h ec t e r m i n a lr e p e t i t i v ef r a g m e n t sp e r f o r m e di n d i v i d u a lp o l y m o r p h i s mb a s e do n c o r eb a s e sm u t a t i o ni n s t e a do fd i f f e r e n td u p l i c a t i o n si nt h eo t h e rf i v es p e c i e s ，w h i l e t h e l e n g t h so ft h er e p e t i t i v es e q u e n c e sa r ea l m o s tt h es a m ea m o n gd i f f e r e n t i n d i v i d u a l sb e l o n gt oo n es p e c i e s a p i sc e r a n aa n da p i sm e l l i f e r a ，卸i sd o r s a t aa n d a p ul a b o r i o s a ，a p i sf l o r e aa n da p i sa n d r e n i f o r m i sf o r m e dt h r e ee v o l u t i o nb r a n c h e s r e s p e c t i v e l yt h er e l a t i o n s h i p sa l ec l o s e rb e t w e e nc e r a n a ，m e l l i f e r aa n dd o r s a t a ， l a b o r i o s at h a nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e r a n a ，m e l l i f e r aa n d f l o r e a ，a n d r e n i f o ，m 括 k e y w o r d ：a p t s卸i s c e r a n a c e r a n am r j p sm o l e c u l a rm a r k e rv n t r p a t r i l i n e s m o l e c u l a re v o l u t i o n i v 1 1 3 东方蜜蜂m r j p s 相关研究7 1 2 m p u p s 交叉比较分析8 1 3 王浆的生物学功能相关研究9 2 分子标记和v n t r 的应用及研究现状以及西方蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 的亚家 系研究1 1 2 1 常用分子标记技术的原理及发展前景1 l 2 1 1 蛋白质标记( a l l o z y m e ；同工酶标记) 1 1 2 1 2 d n a 分子遗传标记1 2 2 1 3 分子遗传标记技术的发展前景1 4 2 2 重复序列分子标记的原理及发展前景1 5 2 2 1m i n i s a t e l l i t e s 1 5 2 2 2m i c r o s a t e l l i t e 1 6 2 2 3v n t r s s r 1 6 第二章用m r j p sv n t r 分子标记测定中华蜜蜂的亚家系2 0 l 材料和方法2 0 1 1 中华蜜蜂的材料及处理2 0 v t 目录 l 材料与方法o o go 3 7 1 1 中华蜜蜂m r j p 2 基因的克隆及测序3 7 1 2 六个蜂种m r j p 2 基因的c 端重复序列片段的克隆与测序3 8 1 2 1 蜂种素材及d n a 提取3 8 1 2 2 m r j p 2 基因c 端重复序列引物设计3 8 1 2 3 p c r 条件( 2 0 i _ t l 反应体系) 3 8 1 2 4 电泳条件3 8 1 2 5 m r j p 2 基因c 端重复片段阳性克隆及测序3 8 1 3 主要试剂及仪器3 9 2 结果3 9 2 1m r s 2 基因的c d n a 全长序列oo 3 9 2 1 1 中华蜜蜂m r j p 2 基因的c d n a 全序列3 9 2 1 2 东、西方蜜蜂m r j f 2 基因的c d n a 序列比较3 9 2 1 3 东、西方蜜蜂m r j p 2 基因e d n a 的c 端重复序列比较4 0 2 2 六大蜂种的m r j p 2 基因的c 端重复序列及其比较结果4 0 2 2 1m r 2 p 2c 端重复片段的p c r 扩增4 0 2 2 2m r j p 2 基因c 端重复序列测序结果及比较分析4 3 2 2 3 蜜蜂属m r j p 2 基因c 端重复序列进化分析4 7 3 结论”4 9 致谢”oo ”“”5 1 参考文献o qiqq q q q i iuo iuo 00000q llo 5 2 附录00 ”5 9 个人简历6 1 在学期间发表的学术论文及研究成果0 80 6 l v i l 缩略词 m r ，p s w s p s r j r f l p a f l ：p r a p d s n p d r s t r s s t r v n t r s s r p l c e d t a d n t p d n a i p t g e d n a p c r t a e t b e t e 1 n r i s x - g a l a m p l b o d h h r m i n s s d s b p 缩略词( a b b r e v ia tio n ) m a j o rr o y a lj e l l yp r o t e i n s w a t e r - s o l u b l ep r o t e i n s r o y a lj e l l y r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m p l i f i e df r a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m d i s p e r s e dr e p e a t ss e q u e n c e t a n d e mr e p e a ts e q u e n c e s h o r tt a n d e mr e p e a t v a r i a b l en u m b e rt a n d e mr e p e a t s i n g l es e q u e n c er e p e a t p o l y m o r p h i ci n f o r m a t i o nc o n t e n t e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et f i p o s p h a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d i s o p r o p y l1 5 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t r i s h c i ，a c e t i ca c i d ，e d t ab u f f e r ir i s h c i ，b r o i ca c i d ，e d t ab u f f e r t e b u 腩r ir i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 3 一i n d o l y l - 1 3 - d g a l a c t o s i d e a m p i c i l l i n l u r i a b e r t a n im e d i u m o p t i c a ld e n s i t y h o u r m i n u t e s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e b a s ep a i r 王浆主要蛋白 水溶性蛋白 蜂王浆 限制性酶切片段长度多态性 扩增片段长度多态性 d n a 随机扩增多态性 单核苷酸多态性 散布重复序列 串联重复序列 短串联重复 数量可变串联重复或小卫星 简单序列重复或微卫星 多态信息含量 乙二胺四乙酸 脱氧核糖核苷三磷酸 脱氧核糖核酸 异丙基p d 硫代半乳糖苷 互补脱氧核糖核酸 聚合酶链式反应 t r i s h c i ，乙酸，e d t a 缓冲液 ir i s h c i ，硼酸，e d t a 缓冲液 t e 缓冲液 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 溴4 氯3 吲哚b d 半乳糖苷 氨苄青霉素 l b 培养基 光密度 小时 分钟 秒 十二烷基磺酸钠 碱基对 v i i i e b o r f r p m i x 蜂王浆是 它对蜜蜂的级 y 1 9 8 8 ) 。蛋 对蜂王的营养 咽下腺和上颚腺共同作用着蜂王浆的分泌( l e n s k yy ，r a k o v e ry 1 9 8 3 ；k n e c h td ， k a a t zh h 1 9 9 0 ) 。 蜂王浆的化学成分分析早在1 9 世纪末就已经开始了，但直到2 0 世纪7 0 年 代，现代分析化学技术的发展和进步才使得人们对蜂王浆的化学成分有了较全 面的认识。蜂王浆的化学成分因季节和区域的不同而有所不同，其平均含水量 为6 0 7 0 ，粗蛋白1 2 - - - 1 5 ，总糖1 0 - - 1 6 ，脂类3 - - 6 ，盐、维生素、 游离氨基酸和未确定物质2 3 ( b r o u w e r se w m ，e ta 1 19 8 7 ；a s e n c o tm ， l e n s k yy 1 9 8 8 ；l e n s k yy ，r a k o v e ry 1 9 8 3 ；t a k e n a k at ，e c h i g ot 1 9 8 2 ；h o w e s r ，e ta 1 1 9 8 5 ；c h e nc ，c h e ns y 1 9 9 5 ；s c h m i t z o v aj ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。王浆蛋白由水 溶性蛋白( w s p s ) 和非水溶性蛋白组成。其中水溶性蛋白占总蛋白含量的 4 6 - 8 9 ，为王浆蛋白的主要部分，称为m r j p s ( m a j o rr o y a lj e l l yp r o t e i n s ) 。 1 1m r j p s 的研究进展 蜜蜂属下有9 个种，但m r j p s 的研究多以西方蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 为实 验材料，部分研究以大蜜蜂和东方蜜蜂为实验材料，其他蜂种的m r j p s 研究未 见报道。 1 1 1 西方蜜蜂m r j p s 的相关研究 西方蜜蜂原产于欧洲、非洲、中东等地区，现已引入除南极外的世界各地 饲养。西方蜜蜂m r j p s 已经有较为详细的研究( 多以西方蜜蜂种下的喀尼鄂拉 亚种为材料) ，其中包括m r j p sc d n a 的克隆及序列分析、m r j p s 的分离纯化和 特征描 1 1 1 西 同源性 s ，e ta 1 制各的 m r j p s m r j p 2 、m r j p 3 s 、m r j p 4 、m r j p 5 s 的c d n a 序列，并由各c d n a 序列的开放读 码框( o r f ) 推断出各m r j p 的氨基酸序列。k l a u d i n y 等获得了m r j p 3 s 和m r j p 4 的c d n a 序列，推断出的氨基酸序列显示它们分别含有5 2 8 个和4 4 9 个氨基酸，其 分子量分别为5 9 5k d a 和5 0 9k d a ，分别含有1 个和8 个n 糖基。序列比对显示两 条e d n a 序列有7 0 2 相同，由它们的o r f 得到的多肽的氨基酸序列有5 6 6 相 同，n o r t h e r n 分析显示总m r n a 中m r j p 3 和m r j p 4 的m r n a 含量分别为8 和2 ( k l a u d i n yj ，e ta 1 1 9 9 4 ) 。s c h m i t z o v a 等测定了编码西方蜜蜂m r j p l 和m r j p 2 的 c d n a 序列，推断出的氨基酸序列显示m r j p l 和m r j p 2 分别含有4 1 6 个和4 3 5 个氨 基酸，其分子量分别为4 6 8k d a 和4 8 9 k d a ，分别含有3 个和2 个n 糖基( s c h m i m o v a j ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。a l b e r t 等测定了编码西方蜜蜂m r j p 5 的c d n a 序列，推断出m r j p 5 含有5 8 1 个氨基酸，分子量为6 8 0k d a ，含有4 个n 糖基( a l b e r ts ，e ta 1 1 9 9 9 a ) 。 分析各种氨基酸的百分比，发现m r j p l 、m r j p 2 和m r a p 5 所含的必需氨基 酸的数量很高，分别为4 8 、4 7 和5 1 4 ，几乎与其他营养蛋白中的必需氨基 酸含量相当，如酪蛋白为4 9 1 ( s t e w a r ta f , e ta 1 1 9 8 4 ) 、鸡蛋清蛋白为5 1 6 ( m c r e y n o l d sl ，e ta 1 1 9 7 8 ) ，而m r j p 3 和m r j p 4 拥有某些必需氨基酸的数量更 高。 分析比较m r j p l 、m r j p 2 、m r j p 3 、m r j p 4 和m r j p 5 的c d n a s 的核苷酸序 列与其推导出的氨基酸序列，结果显示m r j p s 各成员之间的氨基酸同源性高达 6 1 7 4 ，在m r j p 3 ( a a r 4 2 4 5 2 3 ) 和m r j p 5 ( a a r 3 6 7 - 5 4 0 ) 中这一同源性被包 含重复序列的区域所打断。从序列的同源性可以推断m r j p s 是同一个蛋白家族的 成员，m r j p s 是分泌蛋白，其n 端具有疏水区域，类似于真核生物的信号肽 ( s c h m i t z o v aj ，e ta l 。1 9 9 8 ) 。m r j p s 基因家族的每一个c d n a 可以与其他成员的 基因发生交叉反应，a l b e r t 采用s o u t h e r n 杂交的方法验证了这一推断( a l b e r ts ，e t 2 第一章文献综述 a 1 1 9 9 9 a ) 。 a l b e r t 等通过将m r j p s 基因和y e l l o w 基因部分序列和蜜蜂大脑e s t 文库比对， 发现了另外编码3 个同属于m r j p 蛋白家族新成员的c d n a ( m r j p 6 ，m r j p 7 ， m r j p 8 ) ，并设计引物从蜜蜂头部c d n a 文库中p c r 扩增到了其全长e d n a ( a l b e r t s ，k l a u d i n yj 2 0 0 4 ) 。 m a l e c o v a 等人通过p c r 在西方蜜蜂基因组内分离到了包含m r j p l 基因全序列 的基因组克隆，测定了研砌j 基因的全序列，分析了其假定启动子和基因结构， 并作- j m r j p s 基因假定启动子区转录因子d r i 和u s p 结合位点的图谱。基因组d n a 的s o u t h e r n 点迹分析表明所有当时已知的_ ，z ，勿基因家族成员( m r j p j ，m r j p 2 ， m r j p 3 ，m r y p 4 ，m r j p s ) 在每只单倍体蜜蜂基因组中均以单拷贝形式存在( m a l e c o v a b ，e t a l 2 0 0 2 ) 。 1 1 1 2 m r j p s 的分离纯化和特征描述 虽然m p j p s 结构上密切相关，但表达图谱却不一样。m r j p l 的m r n a 在哺育 蜂和采集蜂的咽下腺都很多，而m r j p 2 ，m r j p 3 ，m r j p 4 主要在哺育蜂的咽下 腺合成( m a l e c o v ab ，e ta 1 2 0 0 2 ) 。h a n e s 等通过离子交换层析法分离得到了经哺 育蜂咽下腺蛋白修饰的m r j p s ( h a n e sj ，s i m u t hj 1 9 9 2 ) 。据报道，王浆( 1 u ) 和工蜂浆( w j ) 的主要蛋白含量相似，且同属m r j p 蛋白家族( s c h m i t z o v aj ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。关于m r j p s 的研究开始于上世纪9 0 年代初。至今已发现m r j p s 蛋白家族 共有8 个成员，m r j p l m r j p 8 ( a l b e r ts ，k l a u d i n yj 2 0 0 4 ) 。m r j p l 、2 、3 和m r j p 5 在王浆和工蜂浆中的相对含量依次分别为：3 1 和3 5 、1 6 和1 8 、2 6 和2 4 、 9 和8 。而m r j p 4 的含量很低，其中m r j p 3 和m r j p 5 具有高度多态性 ( s c h m i t z o v aj , e ta 1 1 9 9 8 ；s r i s u p a r b hd ，e ta 1 2 0 0 3 ) 。 s c h m i t z o v a 等通过s d s p a g e 分离，得到的主要电泳条带蛋白的n 端氨基 酸序列，与由m r j p s 的c d n a s 推断的氨基酸序列进行比较验证得出：最主要 条带蛋白的分子量为5 5 k d a ，命名为m r j p l ，其n 端氨基酸序列与r j p l 2 0 c d n a s 所推断的蛋白质氨基酸序列一致；分子量4 9 k d a 蛋白被命名为m r j p 2 ， 对应于r j p 9 5c d n a 核苷酸序列推导出的蛋白质；分子量在6 0 7 0 k d a 的蛋白有 四个，命名为m r j p 3 s ，r j p 5 7 1 蛋白属于m r j p 3 s ；分子量为7 7 k d a 和8 7 k d a 的蛋白被命名为m r j p 5 s ，与m r j p 5c d n a 推导出的序列一致；k l a u d i n y 报道 的r j p 5 7 2 蛋白最后被命名为m r j p 4 ，在s d s p a g e 试验中没有分离出来，可 第一章文献综述 能是在电泳中被其他更丰富的蛋白所覆盖( s c h m i t z o v a j ，e ta 1 1 9 9 8 ；k l a u d i n yj ， e ta 1 1 9 9 4 ；a l b e r ts ，e ta 1 1 9 9 6 ；a l b e r ts ，e ta 1 1 9 9 9 a ) 。 进一步研究显示，m 1 l i p 3 和m r j p 5 均为多态性蛋白，含有相对较多的必 需氨基酸，都有一个大面积的重复区，但这两个重复区之间并不同源( a l b e r ts ， e ta 1 1 9 9 9 a ；a l b e r ts ，e ta 1 1 9 9 9 b ) 。m r j p 3 的重复区有高度多态性，a l b e r t 等 ( a l b e r ts ，e ta l 。1 9 9 9 b ) 在同一蜂群中的1 0 只个体中就找到了5 个等位基因， 且这些等位基因中重复子的个数有明显区别。而与m r j p 3 相比，m r j p 5 的重 复区在蛋白序列上的位置、长度、组成、重复子个数上都不同( a l b e r ts e ta 1 1 9 9 9 a ) 。这一高度多态性等位基因尤其适合作为确定个体基因型的分子标记。 对m r j p 3 多态性的检测相对简单，这可能对今后的蜂学研究中确定个体的基因 型会大有帮助。 b i l i k o v a 等通过离子交换柱层析分离得到了m r j p 2 ，并描述了其分子特征 ( b i l i k o v ak ，e ta 1 1 9 9 9 ) 。s i m u t h 采用超速离心( 2 4 5 0 0 0 9 ，6 c ，5 h ) 的方法 对王浆进行分离，得到黄色的蛋白上清液( 6 1 ，w w ) 、黄棕色的胶质糖沉淀 ( 3 2 ，w w ) 和白色近乎固体的脂肪酸沉淀( 7 ，w w ) 。该超速离心得到的 溶剂化胶质沉淀是比较合适制备m r j p l 的。m r j p l 在王浆中以三种不同的方 式存在：单体( 5 5 k d a ) 、寡聚亚单位( 4 2 0 k d a ) 和与脂肪酸相互作用后产生不 溶于水的沉淀集聚。寡聚m 1 l i p l 的水溶性很好，浓度达到3 0 5 0 时形成一 种坚固的凝胶，推断m r j p l 是一种白蛋白样的蛋白，它在水溶液中具有自我组 装的能力( s i m u t hj 2 0 0 1 ) 。由于m r j p 4 的表达量很少，至今没有在蛋白水平 上分离纯化出m r j p 4 的报道。 1 1 1 3m r j p s 的功能研究 m r j p s 是王浆中的重要营养因子，m r j p s 功能的研究不仅能有助于解释王浆 的作用机理，还有助于了解蜜蜂级型分化的机理。 o h a s h i 等发现与工蜂日龄一致，工蜂咽下腺的主要蛋白合成是从蜂牛乳蛋 白质转变为伐葡糖苷酶的。早先，他们指出o 【葡糖苷酶基因是特定的在采集蜂 咽下腺中表达的( o h a s h ik ，e ta 1 1 9 9 6 ) 。o h a s h i 等分离鉴定了两个5 6k d a 和 6 4k d a 的蜂乳蛋白的e d n a s 。5 6k d a 蛋白是一种糖蛋白，与王浆关联蛋白5 7 1 ( p r j p 5 7 1 ) 和p r j p 5 7 - 2 的e d n a 所编码的蛋白共有6 3 2 和5 6 9 氨基酸序 列一致。6 4k d a 蛋白的e d n a 与p r j p 5 7 1 相同。因此，这些蜂乳蛋白形成了 4 第一章文献综述 一种结构关联蛋白家族。6 4k d a 蛋白r j p 5 7 1 是特别地在哺育蜂咽下腺中表达 的，而5 6k d a 蛋白是在哺育蜂咽下腺和采集蜂咽下腺中表达的。5 6k d a 和6 4 k d a 蛋白的m r n a s 通过原位杂交在哺育蜂咽下腺的整个腺泡中被检测到，而 5 6k d a 蛋白和0 【葡糖苷酶的m r n a s 是在采集蜂咽下腺中被检测到。因此，单独 的咽下腺腺泡分泌细胞显示随着工蜂日龄的转变而不同程度地表达这些基因 ( o h a s h ik ，c ta 1 1 9 9 7 ) 。 j u d o v a 将m r j p l 表达产生的带h i s t a g 的m r j p l 蛋白，检测到王浆的抗敏 性( j u d o v aj ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。b i l i k o v a 等制备了在e c o l i 里异源表达的m r j p 2 ， 该表达产物是8 个具有不同等电点的4 9 k d a 蛋白，等电点在7 5 8 5 之间 ( b i l i k o v ak ，e ta 1 1 9 9 9 ) 。o k a m o t o 等发现m r j p 3 在体内外都有明显的免疫调 节效应( o k a m o t oi ，e ta 1 2 0 0 3 )