（病理学与病理生理学专业论文）a549细胞超微结构体视学研究.pdf

博士学位论文 脚删删 y 1 。7 * , , n 1 7 n w nm0#llr l l 3 i i l | j4 8 i i i l l l 2 i i i i i i a 5 4 9 细胞超微结构体视学研究 博士研究生：江闰德 指导老师：申洪教授 摘要 研究背景和目的 a 5 4 9 细胞来源于人肺泡细胞癌，由g i a r ddj 等于1 9 7 3 年建立。该细胞既具 有肺癌恶性肿瘤细胞的特性，同时又具有肺泡型上皮细胞的特性和表型。故 在研究中a 5 4 9 细胞被广泛用于肺癌的发生、发展、诊断及治疗研究，也被用于 正常人肺泡i i 型上皮细胞的发生、分化及其结构和功能的研究。根据p u b m e d 查 询，到目前为止，使用a 5 4 9 细胞进行研究的英文报道达6 2 0 0 余篇；c n k i 收录的 利用a 5 4 9 细胞进行研究的中文文献多达4 6 0 0 余篇，且中英文献数均逐年呈倍数 级上升。然而，这些报道主要集中予a 5 4 9 细胞功能方面的研究。 众所周知，细胞形态变化是其功能变化的基础，而细胞功能方面的变化又 将影响细胞形态结构。要想提高对细胞功能的理解和认识必须深化对细胞形态 和结构的认识。以往对形态的认识和研究多局限予镜下的定性观察。然而，对 a 5 4 9 细胞的形态结构研究，无论是光学显微镜之“镜下所见”，还是扫描电镜 抑或透射电镜下的超微结构观察，采用的均为经典的视觉描述来反映细胞的形 态结构及其变化，且都局限于二维水平，缺乏形态结构的量化概念，缺乏三维 结构水平的定量研究。而且由于各种视觉错觉的作用，如佐勒错觉和埃宾豪斯 错觉等，有时甚至会得出完全错误的结论。从结构形态来看二维图像也只是显 示三维结构的各种剖面，例如对于二维切片中的圆形结构并不一定意味着其三 维结构为球体，它可能是球体，也可能是椭圆、圆管状或不规则结构等。从结 构数量来看，二维图像一般只能显示三维结构的一部分，有些结构数目少，分 布不均匀时，在二维图像中往往看不到。因此，二维图像上所见的细胞形态， 中文摘要 诸如各种结构的形状、大小、多少都发生了变化，单纯描述镜下所见并不全面， 也不完善。 体视学是由二维结构信息定量推论三维结构信息的介于形态学与数学之间 的新兴学科。应用体视学原理最终可测得细胞的三维结构参数，使人们能从三 维水平定量地阐明细胞的结构。例如，细胞中线粒体的体密度能反映出线粒体 相对体积大小，线粒体数密度反映了线粒体数量多少，线粒体内膜表面积密度 可反映线粒体内膜表面积大小，线粒体的平均自由程则反映出线粒体与线粒体 之间的空间平均距离，或者反映了线粒体是密集还是稀少，而线粒体的曲度、 球度、轴比等则从不同方面反映了线粒体的形态等。其他诸如细胞、核、各种 细胞器及细胞中的包含物等的三维结构特征都可用相应的体视学参数来定量描 述。 本研究利用光镜与电镜拍摄细胞的图像，采用图像分析软件i m a g e p r op l u s 6 0 对a 5 4 9 细胞的图像进行分析，并应用体视学的原理和方法，对a 5 4 9 细胞及其 细胞核内的核仁、常染色质、异染色质以及细胞质内的线粒体、溶酶体、板层 小体及囊泡等超微结构的三维形态特征进行量化，从三维水平定量揭示a 5 4 9 细 胞超微结构的特点。在研究过程中，我们还对影响参数结果的因素进行了校正， 如细胞收缩的校正及测试系统的标定等。 方法 a 5 4 9 细胞株和h b e 细胞株由病理教研室液氮保存。 1 a 5 4 9 细胞光镜及电镜制样收缩系数测试 ( 1 ) 分别用等渗重悬、涂片脏染色、涂片巴氏染色、石蜡包埋3i lm j c j - j 片h e 染色 及透射电镜制样半薄( 3um ) 切片h e 染色5 种常规方法处理细胞； ( 2 ) 用i m a g e - p r op l u s6 0 图像分析软件测试每组细胞的平均直径，然后以 a 5 4 9 培养之等渗重悬细胞之平均直径为基准计算细胞的收缩系数。 2 电镜图像“b a r 尺长度的误差分析 ( 1 ) 用光栅复型标定测试软件并用软件按标定后的标准尺度测量3 5 0 0 倍、8 0 0 0 倍和1 5 0 0 0 倍电镜图像上对应给出的1 0um 、5um 和2l am “b a r 尺的真实长度， 博士学位论文 用测得的“b a r ”尺真实长度与图像所标的长度进行比较分析； ( 2 ) 计算电镜图像“b a r 尺所给的长度与其真实长度间的绝对误差和相对误 差，比较不同放大倍数图像上“b a r ”尺所给的长度与其真实长度间的相对误差 差异程度。 3 a 5 4 9 细胞超微结构体视学研究 ( 1 ) 透射电镜下观察a 5 4 9 细胞内细胞器的结构并予辨认； ( 2 ) 用i m a g e p r op l u s6 0 图像分析软件设计测试系统，应用体视学原理和 方法，测试a 5 4 9 细胞超微结构的体视学参数包括：细胞核体密度( ) 、细胞浆 体密度( v v c , ，) 、细胞核表面积密度( 兔) 、核内常染色质体密度( j 、异染色质 体密度( 。) 、核仁体密度( j 、核仁表面积密度( s v o ) 、线粒体体密度( ) 、 线粒体表面积密度( 瞄、线粒体数密度( 坛儿溶酶体体密度( 、溶酶体表 面积密度( s j 、溶酶体数密度；板层小体体密度( j 、板层小体表面积密度 ( 品舳) 、板层小体数密度( 0 ；囊泡体密度( j 、囊泡表面积密度( 甄，) 、囊 泡数密度( 胍0 ；细胞浆平均体积( ，) 、细胞核平均体积( ) 及平均表面积( 岛) ； 核仁平均体积( ) 及平均表面积( 岛j ；线粒体的平均体积( ) 、平均表面积( ) 及数量( ) ；溶酶体的平均体积( n j 、平均表面积( $ 0 及数量( 力曲；板层小体 的平均体积( 乃j 、平均表面积( 研册) 及数量( 胁0 ；囊泡的平均体积( s ) 、平均 表面积( 乳0 及数量( 力，0 。上述参数中的细胞浆平均体积( 。) 、细胞核平均体 积( ) 及平均表面积( 妁，核仁平均体积( 圪) 及平均表面积( 岛j ，线粒体的平均 体积( ) 、平均表面积( 勘) 及数量( ) ，溶酶体的平均体积( v l r , ) 、平均表面积 ( 两0 及数量( 力j ，板层小体的平均体积( 所0 、平均表面积( 研鲫) 及数量( 力，锄) 及 囊泡的平均体积( n 0 、平均表面积( s j 及数量( 力。j 是指一个a 5 4 9 细胞内对应细 胞器参数的绝对含量。细胞核及浆的密度参数以细胞为参照空间，核仁、常染 色质及异染色质的密度参数以细胞核为参照空间，线粒体、溶酶体、板层小体 及囊泡结构的密度参数以细胞浆为参照空间。 4 a 5 4 9 细胞和h b e 细胞形态结构的差异分析 ( 1 ) 光学显微镜、倒置显微镜、扫描电镜及透射电镜下观察a 5 4 9 细胞和h b e 细 中文摘要 胞的形态特点； ( 2 ) 通过i m a g e p r op l u s6 0 图像分析软件鼠标勾描每幅图像中的细胞、细胞 核和核仁的轮廓，分别测试细胞、细胞核及核仁的面积和周长，并计数细胞内 的胞核数及核内的核仁数，以细胞为参照空间计算h b e 细胞和a 5 4 9 细胞核及核仁 形态的体视学参数：包括细胞核体密度( 呦、细胞核表面积密度( 兔) 、细胞核 表面积与体积比( 尼0 、细胞核数密度( a 铀、细胞核平均体积( ) 、细胞核平均 表面积( 蜀) 和核浆比( r o , ) ；细胞核仁的体视学参数包括核仁体密度( j 、核仁 表面积密度( 瓯u ) 、核仁表面积与体积比( 尼场0 、核仁数密度( 坛。) 、核仁平均体 积( 0 、核仁平均表面积( 昂。) 共1 3 种体视学参数的数值。 ( 3 ) 以h b e 细胞核及核仁形态参数值为基准，计算a 5 4 9 细胞核及核仁形态的正 负偏离度。 结果 1 a 5 4 9 细胞光镜及电镜制样的收缩系数测试 ( 1 ) a 5 4 9 细胞平均直径的测试结果 等渗液重悬a 5 4 9 细胞的平均直径为1 4 9 3 0 2um ，范围在1 0 0 2 4 8 1 9 3 5 5 2um 之间，变异系数为0 0 9 9 8 ；涂片h e 染色a 5 4 9 细胞的平均直径为 9 8 7 7 5 pm ，范围在7 5 6 5 1 1 4 4 6 1 1pm 之间，变异系数为0 1 0 0 9 ；涂片巴氏染 色a 5 4 9 细胞的平均直径为9 9 7 7 2um ，范围在7 6 6 9 7 1 4 5 4 2 2um 之间，变异系 数为0 1 0 7 1 ：石蜡包埋3pm 厚切片h e 染色a 5 4 9 细胞的平均直径为1 0 2 9 1 4um ， 范围在6 0 9 5 2 1 6 1 0 4 6 | jm 之间，变异系数为0 1 4 1 9 ；透射电镜半薄切片h e 染 色a 5 4 9 细胞的平均直径为1 0 5 8 5 7um ，范围在3 6 8 5 3 2 0 3 4 6 2l lm 之间，变异 系数为0 2 6 5 3 。 ( 2 ) a 5 4 9 细胞收缩系数的计算结果 以等渗重悬细胞的平均直径为基准，涂片h e 染色、涂片巴氏染色、石蜡包 埋3pm 厚切片和透射电镜制样环氧树脂包埋3um 厚切片h e 染色后细胞的收缩系 数分别为：0 6 6 、0 6 7 、0 6 9 和o 7 1 。经过涂片h e 染色、涂片巴氏染色、石蜡 包埋切片h e 染色和电镜制样半薄切片h e 染色后a 5 4 9 细胞均有较明显的收缩，其 i v 博士学位论文 平均直径与等渗重悬的a 5 4 9 细胞的平均直径比较差异均有显著性( p = 0 0 0 0 ) 。 2 电镜图像“b a r 尺长度误差的测试 ( 1 ) 电镜图像上“b a r 尺的真实长度测试结果 3 5 0 0 倍图像长度为1 0um “b a r 尺的真实长度均值为1 0 3 1 3 7l lm ，范围在 1 0 3 0 6 5 1 0 3 4 1 0pm 之间，变异系数为0 0 0 1 1 ；8 0 0 0 倍图像长度为5um “b a r 尺的真实长度均值为5 1 4 2 4um ，范围在5 1 3 6 0 一- - 5 2 0 7 9l lm 之间，变异系数为 0 0 0 2 4 ；1 5 0 0 0 倍长度为2um “b a r 尺的真实长度均值为1 9 2 6 5um ，范围在 1 9 1 3 2 一- 1 9 3 3 7um 之间，变异系数为0 0 0 4 6 。3 5 0 0 倍、8 0 0 0 倍和1 5 0 0 0 倍电镜 图像上“b a r 尺的长度与其真实长度间的比较差异均有显著性( 肛- - 0 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 电镜图像上“b a r 尺长度与其真实长度间的绝对误差计算结果 3 5 0 0 倍图像“b a r ”尺长度与其真实长度间的绝对误差均值为0 3 1 3 7um ， 范围在0 3 0 6 5 0 3 4 1 0um 之间，变异系数为0 0 3 6 3 18 0 0 0 倍图像“b a r 尺 长度与其真实长度间的绝对误差均值为0 1 4 2 4um ，范围在0 1 3 6 0 0 2 0 7 9um 之间，变异系数为0 0 8 8 0 ；1 5 0 0 0 倍图像“b a r 尺长度与其真实长度间的绝对 误差均值为0 0 7 3 5um ，范围在0 0 6 6 3 0 0 8 6 8um 之间，变异系数为0 1 2 1 0 。 ( 3 ) 电镜图像上“b a r 尺长度与其真实长度间的相对误差计算结果 3 5 0 0 倍图像“b a r 尺长度与其真实长度间的相对误差均值为3 0 4 ，范围在 2 9 7 - - - 3 3 0 之间，变异系数为3 6 2 ；8 0 0 0 倍图像“b a r 尺长度与其真实长 度间的相对误差均值为2 7 7 ，范围在2 6 5 ，- - - 3 9 9 之间，变异系数为8 3 0 1 1 5 0 0 0 倍图像“b a r 尺长度与其真实长度间的相对误差均值为3 8 2 ，范围在 3 4 3 4 5 4 之间，变异系数为1 2 5 6 。3 5 0 0 倍、8 0 0 0 倍和1 5 0 0 0 倍电镜图像 “b a r ”尺长度与其真实长度间的相对误差三种不同放大倍数整体比较差异有 显著性( f - - 5 8 8 6 2 ，尸生0 0 0 0 ) 。3 5 0 0 倍、8 0 0 0 倍和1 5 0 0 0 倍电镜图像上“b a r 尺长度与其真实长度间的相对误差两两比较差异均有显著性( 胆0 0 0 0 ) 。 3 a 5 4 9 细胞三维超微结构的形态分析 ( 1 ) a 5 4 9 细胞透射电镜下超微结构观察 v 中文摘要 a 5 4 9 细胞表面有大量的短小微绒毛。细胞质丰富，内有各种细胞器如线粒 体、溶酶体、内质网、高尔基复合体、板层小体、粘液空泡和微囊等。线粒体 在细胞中分布不均一，呈极性分布；溶酶体大部分属于自噬溶酶体，由单位膜 包绕，其内含有残余的细胞器；板层小体为圆形或卵圆形，内部有呈平行或螺 纹状排列的板状结构：微囊的腔面见微绒毛，腔内有不同电子密度的分泌物； 粘液空泡往往几个或一群密集分布，其电子密度较低。局部区域内质网、高尔 基复合体结构丰富。细胞核大，核形不规则，可见极不规则核；核膜皱褶多； 染色质细密，常染色质占大部分；核内可见一个或多个核仁。观察、辨认细胞 电镜图像发现板层小体和微囊两种超微结构，可作为鉴定a 5 4 9 细胞的佐证之一。 ( 2 ) a 5 4 9 细胞超微结构形态的量化特点 a 5 4 9 细胞核及浆形态的量化特点 均值为0 2 7 8 9 ，其9 5 的可信区间在0 2 4 5 1 0 3 1 2 9 之间，变异系数为 0 2 1 9 1 ；，均值为0 7 2 11 ，其9 5 的可信区间在0 6 8 7 1 0 7 5 4 9 之间，变异 系数为0 0 8 4 7 ；瓜为0 6 3 ；s v o 均值为0 1 9 3 4i jm 一，其9 5 的可信区问在0 1 7 8 5 0 2 0 7 5i im 叫之间，变异系数为0 2 0 0 4 ；尼物为0 6 7 ；均值为4 6 5 7 6l zm 3 ，其 9 5 的可信区间在4 0 9 2 5 一- - - , 5 2 2 2 7um 3 之间，变异系数为0 2 0 9 1 ；v c v 。均值为 1 2 0 4 2um 3 ，其9 5 的可信区间在1 1 4 7 7 - - - 1 2 6 0 7um 3 之间，变异系数为0 0 8 4 7 ； 品均值为3 2 2 9 2um 2 ，其9 5 的可信区间在2 9 8 7 6 - - , 3 4 7 0 8l lm 2 之间，变异系数 为0 2 0 0 4 。 a 5 4 9 细胞核内核仁、常染色质及异染色质形态的量化特点 。均值为0 0 7 6 1 ，其9 5 的可信区间在0 0 7 3 9 一- - 0 0 7 8 1 之间，变异系数为 0 0 5 7 1 ；s v o 。均值为0 1 5 0 8l am 一，其9 5 的可信区间在0 1 4 2 4 0 1 5 9 6um 1 之间， 变异系数为0 1 5 1 8 ，因此a 5 4 9 细胞核仁的表面积与体积比为1 9 8 。均值为 3 5 6 2 3pm 3 ，其9 5 的可信区间在3 4 4 9 7 3 6 7 4 9l lm 3 之间，变异系数为0 0 5 7 1 ； 品。均值为7 0 5 1 7l li n 2 ，其9 5 的可信区间在6 6 5 2 1 7 4 5 1 3um 2 之间，变异系 数为0 1 5 1 8 。均值为0 7 2 2 5 ，其9 5 的可信区间在0 7 0 9 7 一- - 0 7 3 6 3 之间， 变异系数为0 0 3 7 2 ；。均值为3 3 7 8 5ui n 3 ，其9 5 的可信区间在3 3 1 7 3 v i 博士学位论文 3 4 3 9 7l am 3 之间，变异系数为0 0 3 7 2 。，均值为0 2 0 1 2 ，其9 5 的可信区间在 0 1 8 8 3 - 0 2 1 3 7 之间，变异系数为0 1 1 6 4 ；。，均值为9 4 1 1 4um 3 ，其9 5 的可 信区间在8 8 0 4 7 - - - - 1 0 0 1 81 lm 3 之间，变异系数为0 1 1 6 4 。 a 5 4 9 细胞线粒体形态的量化特点 均值为0 0 4 6 0 ，其9 5 的可信区间在0 0 4 4 3 - - - 0 0 4 7 7 之间，变异系数为 0 0 8 8 3 ；鼠，均值为0 5 9 8 8pm ，其9 5 的可信区间在0 5 0 4 5 - - - 0 6 9 3 5l am - 1 之间， 变异系数为0 5 6 3 8 ；n v , ，均值为0 3 0 0 3l lm - 3 ，其9 5 的可信区间在0 2 2 9 6 ，- - 0 3 7 0 4um q 之间，变异系数为0 4 9 7 7 。，均值为6 1 9 1 0um 3 ，其9 5 的可信区 间在5 8 8 8 2 - - - 6 4 9 3 8l im 3 之间，变异系数为0 0 8 8 3 ；s n l 均值为1 0 0 1 6 7i jm 2 ， 其9 5 的可信区间在8 8 8 0 9 1 1 1 5 3um 2 之间，变异系数为0 5 6 8 3 ；一个a 5 4 9 细胞含仡，约5 0 1 个，其9 5 的可信区间在3 8 4 6 1 8 个之间，变异系数为0 4 9 7 7 。 a 5 4 9 细胞溶酶体、板层小体和囊泡形态的量化特点 期值为0 0 2 5 0 ，其9 5 的可信区间在0 0 1 6 2 - 0 0 3 3 8 之间，变异系数为 0 6 2 4 2 ：。均值为0 0 1 2 9 ，其9 5 的可信区间在0 0 0 9 1 0 0 1 1 9 之间，变异系 数为0 5 1 7 7 ；。，均值为0 0 3 9 0 ，其9 5 的可信区间在0 0 3 9 7 - - 0 0 4 0 1 之间，变 异系数为0 0 4 6 6 。踮均值为0 3 5 6 5um - 1 ，其9 5 的可信区间在0 2 7 1 5 0 4 4 2 5l am _ 1 之间，变异系数为0 6 4 3 2 ；品，均值为0 1 7 6 3l am - 1 ，其9 5 的可信区 间在0 0 9 8 7 - - 0 2 5 3 3 | lm - 1 之间，变异系数为1 1 7 4 4 ；鼠。瀚值为1 1 6 1 2i am - 1 ，其 9 5 的可信区间在1 0 4 8 5 - - 1 2 7 3 5um 叫之间，变异系数为0 2 5 9 1 。均值为 0 5 6 9 1um 一，其9 5 的可信区间在0 4 3 3 7 - - - 0 7 0 4 3 | lm - 3 之间，变异系数为0 7 1 2 7 ； 畅。均值为0 1 2 8 9um ，其9 5 的可信区间为0 0 8 7 4 - - - 一0 1 7 0 61 tm 1 之间，变异系 数为0 4 6 2 4 ；胍。均值为1 0 4 2 4 um 一，其9 5 的可信区间在8 7 2 0 6 - 1 2 2 7 4 um - 3 之间，变异系数为0 3 1 7 8 ；n 。均值为7 6 8 2 0 | lm 3 ，其9 5 的可信区间在6 2 3 8 4 一- 9 1 2 5 7um 3 之间，变异系数为0 6 2 4 2 ；均值为2 1 6 9 4um 3 ，其9 5 的可信区间 在1 5 4 7 4 2 7 9 1 4 | im 3 之间，变异系数为0 5 1 7 7 ；均值为6 5 2 4 11 lm 3 ，其9 5 的可信区间在6 3 7 7 4 6 6 7 0 8um 3 之间，变异系数为0 0 4 0 6 ；s j 。均值为 4 2 8 6 8pm 2 ，其9 5 的可信区间在3 2 5 7 3 一- - 5 3 1 6 3i am 2 之间，变异系数为0 6 4 3 2 ； v i l 中文摘要 s ，均值为2 1 2 0 4p1 1 1 2 ，其9 5 的可信区间在1 1 9 。0 6 - - 3 0 5 0 2um 2 之间，变异系数 为1 1 7 4 4 ；s ，。均值为1 3 9 6 2pm 2 ，其9 5 的可信区间在1 2 6 1 1 1 5 3 1 3i lm 2 之间， 变异系数为0 2 5 9 1 ；一个a 5 4 9 细胞内，7 ，。约含9 5 0 个，其9 5 的可信区间在7 2 4 1 1 7 5 个之间，变异系数为0 7 1 2 7 ；n ，约含2 1 5 个，其9 5 的可信区在1 4 6 一- - 2 8 4 个 之间，变异系数为0 4 6 2 4 ；力。约含1 7 4 0 9 个，其9 5 的可信区间在1 4 5 6 4 2 0 2 5 3 个之间，变异系数为0 3 1 7 8 4 a 5 4 9 和t t b e 细胞形态结构差异分析 ( 1 ) 倒置显微镜和细胞爬片h e 染色观察结果 a 5 4 9 细胞和h b e 细胞均为大小不一、形态多样。a 5 4 9 以梭形、多角形细胞 为主，散在、单层排列，h b e 细胞以多边形上皮样细胞为主，梭形细胞只占极少 数，镶嵌排列。h b e 细胞形态相对a 5 4 9 较一致。 ( 2 ) 扫描电镜及透射电镜下a 5 4 9 细胞和h b e 细胞形态观察结果 扫描电镜下：i i b e 细胞和a 5 4 9 细胞的表面可见细胞皱褶、突起和细小均匀 分布的纤毛。透射电镜观察，h b e 细胞和a 5 4 9 细胞中可见不规则细胞核，其内 见一个或多个核仁。 ( 3 ) a 5 4 9 细胞及t t b e 细胞核及核仁形态差异定量分析结果 以h b e 细胞核及核仁的形态参数为基准，a 5 4 9 细胞核体密度、核表面积密度、 核数密度和核表面积与体积比的负偏离度分别为2 1 1 4 、2 7 9 6 、5 0 和 3 2 8 7 ，a 5 4 9 细胞核平均体积、核平均表面积和核浆比的正偏离度分别为 1 4 6 9 8 、5 9 6 5 和1 2 9 0 ，a 5 4 9 细胞核仁体积密度、核仁表面积密度、核 仁数密度及核仁表面积与体积比的负偏离度为7 8 1 、3 3 6 3 、4 3 6 8 和 3 6 6 4 ，a 5 4 9 细胞核仁的平均体积、核仁平均表面积的正偏离度分别为5 3 4 9 和1 3 4 8 。 结论 1 a 5 4 9 细胞经过涂片h e 染色、涂片巴氏染色和石蜡包埋3um 切片h e 染色及 透射电镜制样半薄( 3um ) 切片脏染色后会明显收缩，收缩系数分别为：6 6 、6 7 、 6 9 和7 1 。处理方式不同，a 5 4 9 细胞收缩程度不同。 博士学位论文 2 电镜图像给出的“b a r 尺的长度与真实长度有误差，相对误差可达3 左右；不同放大倍数“b a r ”尺的误差程度不同 3 a 5 4 9 细胞其超微结构具有以下量化特点 ( 1 ) a 5 4 9 细胞胞质约占细胞体积的7 2 ，细胞核约占细胞体积的2 8 ；以胞 核为参照空间，核仁约占8 ，染色质占9 2 ，而染色质中7 6 9 是以常染色质的 形式出现，异染色质约占2 3 1 ；线粒体约占胞质的4 6 、板层小体约占胞质 的2 5 、溶酶体和囊泡各约占胞质的1 3 9 和3 9 0 。 ( 2 ) 平均一个a 5 4 9 细胞内约含5 0 1 个线粒体，其表面积总量为1 0 0 1 6 7um 2 ； 约含9 5 0 个板层小体，其表面积总量为4 2 8 6 8um 2 ；约含2 1 5 个溶酶体，其表面积 总量为2 1 2 0 4l lm 2 ；约含1 7 4 0 9 个囊泡，其表面积总量为1 3 9 6 2um 2 。 4 a 5 4 9 细胞和h b e 细胞光镜下形态有差异，扫描电镜和透射电镜观察表明 两组细胞形态相似。a 5 4 9 细胞核及核仁的形态与h b e 细胞核及核仁的形态相比， 核的平均偏离度为5 6 4 3 ，核仁的平均偏离度为3 1 4 6 。 创新之处 1 首次用体视学的方法从量化角度及三维结构水平对a 5 4 9 细胞的超微 结构进行了定量研究，a 5 4 9 细胞内胞质体积约占细胞体积的7 2 ，细胞核体积约 占细胞体积的2 8 ；以胞核为参照空间，核仁约占8 ，染色质占9 2 ，而染色质 中7 6 9 是以常染色质的形式出现，异染色质约占2 3 1 ；线粒体约占胞质的4 6 、板层小体约占胞质的2 5 、溶酶体和囊泡各约占胞质的1 3 9 和3 9 0 。 平均一个a 5 4 9 细胞内约含5 0 1 个线粒体，其表面积总量为1 0 0 1 6 7t im ；约含9 5 0 个板层小体，其表面积总量为4 2 8 6 8um 2 ；约含2 1 5 个溶酶体，其表面积总量为 2 1 2 0 4um 2 ；约含1 7 4 0 9 个囊泡，其表面积总量为1 3 9 6 2pm 2 。 2 首次以未固定、未脱水之a 5 4 9 细胞等渗重悬之平均直径为基准，测试其 经过涂片h e 染色、涂片巴氏染色和石蜡包埋3 | lm 切片h e 染色及透射电镜制样半 薄( 3um ) 切片h e 染色后的细胞收缩系数，发现a 5 4 9 细胞经过涂片h e 染色、涂片 巴氏染色和石蜡包埋3um 切片h e 染色及透射电镜制样半薄( 3pm ) 切片h e 染色后 会明显收缩，收缩系数分别为0 6 6 、0 6 7 、0 6 9 和0 7 1 ；处理方式不同，a 5 4 9 i x 中文摘要 细胞收缩程度不同，为光镜及电镜下对该细胞进行细胞及亚细胞的定量研究奠 定了基础。 3 对电镜图像所给“b a r 尺的真实长度进行测试，发现电镜图像“b a r 尺所标的长度与其真实长度间会存在误差且不同放大倍数其误差程度不等。 4 应用体视学的原理和方法首次定量比较了a 5 4 9 细胞与h b e 细胞核及核仁 的差异，结果表明：a 5 4 9 细胞与h b e 细胞相比，其核的平均偏离度为5 6 4 3 ， 核仁的平均偏离度为3 1 4 6 。 关键词a 5 4 9 细胞；h b e 细胞；三维结构；形态学；体视学；图像分析；定量。 x 博士学位论文 s t e r e o l o g i c a ls t u d y o nt h eu l t r a s t r u c t u r eo f a 5 4 9c e l l s p hdc a n d i d a t e ：r u n d ej i a n g s u p e r v i s o r ：p r o f h o n gs h e n b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e a b s t r a c t a 5 4 9h u m a nl u n ga d e n o c a r c i n o m ae e l l l i n e ，d 嘶v e df r o mh u m a na l v e o l a re e l l c a r c i n o m a ，h a sam u l t i c o n t a i n i n gb o d yw i t h i nc y t o p l a s m t h e s eb o d yi st y p i c a li n t h el u n ga l v e o l a rt y p ei ie p i t h e l i a lc e l l s ，s oa 5 4 9c e l l sw e r ew i d e l yu s e db o t hf o r d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fl u n gc a n c e rr e s e a r c h ，b u ta l s of o rt h ed e v e l o p m e n ta n d d i f f e r e n t i a t i o no fl u n ge p i t h e l i a lc e l l si ns c i e n t i f i cr e s e a r c h a c c o r d i n gt op u b m e d ，b y t h en o w , m o r et h a n6 3 0 0a r t i c l e su s i n ga 5 4 9c e l l sw e r er e p o r t e d t h e s ed o c u m e n t s m a i n l yf o c u s e do nt h ef u n c t i o n a ls t u d i e so f a 5 4 9c e l l s h o w e v e r , i tw a sw e l lk n o w nt h a tt h ec h a n g e so fc e l lm o r p h o l o g yw a st h eb a s i s o ft h e i rf u n c t i o na n di nt u mt h ec h a n g e so fc e l lf u n c t i o nc a na l s oa f f e c tm o r p h o l o g y o fc e l l t oi n c r e a s eu n d e r s t a n d i n go fc e l lf u n c t i o nm u s tb ed e p e n d e n to nt h e k n o w l e d g ea n du n d e r s t a n d i n go ft h em o r p h o l o g ya n ds t r u c t u r eo f c e l l m o r p h o l o g i c a ld e s c r i p t i o nw a st h eb e s tm e t h o d si nt h e r e s e a r c h b i o l o g i c a l m o r p h o l o g y a l t h o u g hal o to fq u e s t i o n sc a nb er e s o l v e d t h e r ea r e al o to f s h o r t c o m i n g s m o r p h o l o g i c a ld e s c r i p t i o nw a ss u b j e c t i v e w ek n o wt h a tb o t ht h e d e s c r i p t i o no ft h e ”m i c r o s c o p i cs e e n ”a n dt h eu l t r ar e a l i s t i cu n d e rt h eo p t i c a lo r s c a n n i n go rt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p er e f l e c t i n gt h es t r u c t u r ea n dc h a n g e s a b o u tm o r p h o l o g y , w h i c ha r el i m i t e dt ot w o - d i m e n s i o n a ll e v e la n dh a v en on u m b e ro f s t r u c t u r e s o m e t i m e sc o n c l u s i o n sw e r ec o m p l e t e l yw r o n gb e c a u s eo fav a r i e t yo f i l l u s i o ns u c ha sz o l l e re b b i n g h a u si l l u s i o ne t c f o re x a m p l e ，ac i r c u l a ri nt h et w o d i m e n s i o ns t r u c t u r ed o e sn o tm e a nn e c e s s a r i l yt h a tt h e i rt h r e e d i m e n s i o ns t r u c t u r e a b s t r a c t w a st h es p h e r e i tm a yb eas p h e r e ，o v a l ，r o u n do ri r r e g u l a rt u b u l a rs t r u c t u r e s t h e s t r u c t u r a lv i e wo ft w o d i m e n s i o n s h a p eo n l yd i s p l a y e dt h e v a r i o u sp r o f i l e so f t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e t h es t r u c t u r a ln u m b e r i c a lv i e wo ft w o d i m e n s i o n a l p i c t u r eo n l ys h o wap a r to ft h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e s o m es m a l ls t r u c t u r ec a r ln o t b ef o u n di nt w o - d i m e n s i o ni m a g e t h u st h em o r p h o l o g yo fc e l ls e e nf r o mt w o d i m e n s i o ni m a g e ss u c ha st h es h a p e ，s i z e ，n u m b e ro ft h ev a r i o u ss t r u c t u r e sw i l l c h a n g e t h es i m p l ed e s c r i p t i o no ff i n d i n g sf r o mo p t i c a lo re l e c t r o nm i c r o s c o p ew e r e v e r yc o m p r e h e n s i v eo ri n c o m p l e t e s t e r e o l o g yi st h es t u d yo f ft h r e e d i m e n s i o n a lo b j e c t st h r o u g ht h ei n t e r p r e t a t i o n o ft w od i m e n s i o n a li m a g e s t h i si su s e f u ln o to n l yb e c a u s ei ta l l o w su st os t u d yt h e s t r u c t u r eo fe n t i r ec e l l sa n dt i s s u e sb a s e do nt h i ns e c t i o n so rp h o t o m i c r o g r a p h so f s e c t i o n s ，b u ta l s ob e c a u s ei ta l l o w su st os t u d yt h i ss t r u c t u r a lq u a n t i t a t i v e l y f o r e x a m p l e ，t h ev o l u m ed e n s i t yo fm i t o c h o n d r i ac o u l dr e f l e c tt h er e l a t i v ev o l u m eo f m i t o c h o n d r i a ；t h en u m b e r i a ld e n s i t yo fm i t o c h o n d r i a lc a nr e f l e c tt h en u m b e ro f m i t o c h o n d r i a ；t h es u r f a c ed e n s i t yo fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ec a nr e f l e c tt h e m i t o c h o n d f i a lm e m b r a n es u r f a c ea r e a ；t h em e a nd i s t a n c eo fm i t o c h o n d r i ac a nr e f l e c t t h ea v e r a g es p a c eb e t w e e nm i t o c h o n d r i aa n dm i t o c h o n d r i ao rr e f l e c tt h a tt h ea v e r a g e d i s t a n c eb e t w e e nm i t o c h o n d r i aa n dm i t o c h o n d r i aa r ed e n s eo rs p a r s e m o r f u r t h e r , t h e t h r e e d i m e n s i o ns t r u c t u r a lf e a t u r e so fn u c l e a r , v a r i o u so r g a n e l l e s0 1 i n c l u s i o n se t c c a nb e e ne x p r e s s e du s i n gs t e r e o l o g i c a lp a r a m e t e r s i np r e s e n ts t u d y , t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f a 5 4 9c e l l s ，n u c l e i ，n u c l e o l i ， e u c h r o m a t i n ，h e t e r o c h r o m a t i n ，m i t o c h o n d f i 如l y s o s o m e s ，l a m e l l a rb o d ya n dv e s i c l e s w e r eq u a n t i f i e df r o mt h ei m a g e so fl i g h tm i c r o s c o p ya n de l e c t r o nm i c r o s c o p yb yt h e a p p l i c a t i o no fs t e r e o l o g i c a lp r i n c i p l e sa n dm e t h o d su s i n gi m a g ea n a l y s i ss o f t w a r e i m a g e p r op l u s6 0 t h en o r m a lm o r p h o l o g yp a r a m e t e ro fc e l l ，n u c l e u sa n do t h e r u l t r a s t r u c t u r ew e r ee s t a b l i s h e d t h ef e a t u r e so fa 5 4 9c e l l sw e r eo b t a i n e df r o mt h e t h r e e d i m e n s i o ns t r u c t u r a li n f o r m a t i o n i nt h ec o u r s eo ft h es t u d y , w ec a l i b r a t i o n s o m ea f f e c tf a c t o r so ft h ep a r a m e t e r ss u c ha sc e l lc o n t r a c t i o na n dc a l i b r a t i o no ft e s t s y s t e m 博士学位论文 m e t h o d s 1 c o n t r a c t i o nc o e f f i c i e n to fa 5 4 9c e l l si n p r e p a r a t i o nf o rl i g h t a n d