【毕业学位论文】（Word原稿）猪囊尾蚴dUTPase的表达、活性分析及结构预测预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪囊尾蚴 表达、活性分析 及 结构 预测 I 摘 要 猪囊尾蚴病 （ 是由猪带绦虫 （ 的幼虫猪囊尾蚴（ 所 引 起的一种人畜共患病。 该病广泛存在于发展中国家，不仅严重影响养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康。因此， 1993 年 世界 卫生组织将猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一 。目前，囊虫病的防治以疫苗免疫和药物治疗为主，但 普遍存在疫苗保护力不够、药物的毒 副 作用太大等缺点，所以新型疫苗和药物的研制一直是人们关注的焦点。 磷酸酶 (一种重要的 制修饰酶，广泛存在于各种生物有机体中， 可特异性水解 生 止 制过程中 度过高而 引起的 错误 掺 入，提高了 制的精确性。近年来 为一种新的药物靶蛋白越来越受到人们的重视，许多病毒、细菌和寄生虫 的 体结构被解析， 研究 抗囊尾蚴病中的作用， 为 药物设计和开发提供了有力的支持。 本实验首次成功克隆出猪囊尾蚴 CY 因，测序结果显示与已知的猪带绦虫六钩蚴 因的核苷酸同源性为 100%。为进一步研究 CY 生物学功能，将其 与 体连接后 在大肠杆菌 中 进行了大量表达， 表达产物 主要以可溶性形式存在 。 同时 将 载体 进行相同的表达纯化对照实验 ， 重组表达菌液的超声上清经镍琼脂糖凝胶纯化后 进行 测 ， 结果 只是在重组猪囊尾蚴液上清中 出现 21小的特异性条带 ， 这说明 本实验 表达纯化的 CY 完全排除了宿主 污染。 化底物（ 成 焦磷酸（ 钼酸铵形成的复合物 在 575特定 的光吸收值 ，测定 575 就能 计算出 量。 在CY 催化反应中， 通过测定产物 位时间的生成量 来 计算底物的消耗量 ， 以此 计算酶的 催化 活力。 结果显示重组 分钟水解 1需的酶量为 纯化 的 个酶活力单位为 酶的比活力为 酶促反应体系中加入不同 金属离子或 测定 力 的变化，结果 以抑制 CY 活性； 而 金属离子 可以增强 酶 的活性。 同时金属离子 还 可以恢复 被 制 的 活性，其中以 恢复 效果最明显，可以使 活性 恢复 在所测定的四种金属离子中， 性的增强作用最明显。 为 进一步研究 CY 构和功能的关系，用 接 构建了 CY D 模型 ， 通过 F、 序对 模型 进行 立体化学结构、能量分布 的 质量 评估 ， 模型评估的得分 结果表明 所建模型 结构合理 。 序的 口袋分析 显示 CY 有 27 个活性口袋，其中第 26 号口袋主要由 CY 构成，该发夹结构是大多数已知晶体结构的三聚体 性口袋的重要组成部分，表明 CY 能 与其它三聚体 有同样的催化机制。 CY 端的 集区（ ， 83） 和 90） 等这些关键氨基酸与其它三聚体 高度保守，这些氨基酸不仅能维持口袋区正常的空间结构，同时也在酶与底物的识别中起 决定性 作用。通过对不同类型 体结构的分析 ， 推测 CY 于同源三聚体 。用 序 预测 了 CY 四级 构，该结构显示 CY 活性区是由 3 个 亚基各自的 端环肽链共同组成，这与大多数三聚体 催化活性区 结构 相 一致。 将 CY 四级结构与已知三聚体 晶体结构进行叠合，结果显示两者能很好的吻合，证明构建的 CY 级结构 合理 。 成功构建的 CY D 模型为抗囊虫药物的设计和开发提供了一个良好的研究模型。 通过在线服务器设计 CY 位点 ， 针 对靶序列设计 时， 在其 3端引入一段与鼠 动子 3端同源互补序列 ， 5端则加入一段下游通用 引 物，设计好的 司 合成 。从鼠的肌肉 中提取 基因组 并 扩增出 动子 序列 ，将 动子和 起退火延伸， 分别 用 动子的 上 游引物和 下 游引物进行 用重叠延伸一步法制备 CY 达 盒 （ 选取猪囊尾蚴肌动蛋白基因（ 为内参 照 ，建立了 CY 因 半定量 CY 涉表 盒 的制备 和 半定量 检测方法的建立，为 CY 研究奠定了基 础， 同时也为 囊虫病 反义药物的研制 提供 了理论依据 。 关键词 ： 猪囊尾蚴 ， 克隆表达 ， 活性分析 ， 同源建模 ， 达盒 is an is in of a to of a is in of to Pi NA as a of In to Y At as a by Y 21by s of to of D 75nm of Pi of of of mg of 0%. D of in of F 7 in It 6 3)、 0) Y we to D In we Y a by a 6 to of o. 6 CR CR 6 Y IV CR in as an to of of V 目 录 英文缩略表 . 0 第一章 绪论 . 1 囊尾蚴病的诊断和防治研究进展 . 1 囊尾蚴病概述 . 1 虫病的诊断 . 2 囊尾蚴病的预防和治疗 . 3 结构和催化机理研究进展 . 6 结构特征 . 6 催化机理 . 11 研究的目的和意义 . 15 第二章 猪囊尾蚴 克隆、原核表达及纯化 . 16 言 . 16 料和试剂 . 17 种和试剂 . 17 仪器与设备 . 17 培养基和溶液配制 . 17 验方法 . 18 囊尾蚴总 提取 . 18 增 . 19 目的基因的克隆 . 20 原核表达载体的构建 . 22 重组 诱导表达及条件优化 . 23 表达产物的纯化 . 23 纯化产物的蛋白质浓度测定（ . 24 果 . 24 猪囊尾蚴 因的克隆 . 24 因的序列分析 . 26 猪囊尾蚴 因原核表达 . 28 表达产物的纯化和蛋白质含量测定 . 29 论 . 30 第三章 重组猪囊尾蚴 酶活性分析 . 32 言 . 32 料和方法 . 33 验溶液 . 33 准曲线的绘制 . 33 底物特异性实验 . 33 组 活力单位和比活力的测定 . 34 属离子和 重组 力的影响 . 34 果 . 34 准曲线的绘制 . 34 物的特异性实验 . 35 活力测定 . 36 属离子与 性的关系 . 37 论 . 38 第四章 猪囊尾蚴 同源建模及分析 . 39 言 . 39 料和方法 . 40 要数据库及软件简述 . 40 源建模的主要步骤 . 42 果 . 43 Y 同源序列对比 . 43 Y 二级结构分析 . 43 Y 源建模 . 44 Y 维模型的质量评估 . 45 Y 级结构的预测 . 49 Y D 模型与 构的叠合 . 50 论 . 51 第五章猪囊尾蚴 因 达盒（ 构建 . 53 言 . 53 料和方法 . 54 剂和寡核苷酸的合成 . 54 动子的制备 . 54 板的制备 . 54 制备 . 55 测方法的建立 . 56 果 . 57 6 启动子的扩增 . 57 制备 . 58 测 效果 . 58 论 . 59 第 6 章 全文结论 . 60 参考文献 . 61 致 谢 . 69 作者简历 . 70 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 囊尾蚴 脱氧尿苷 三磷酸酶 aa 氨基酸 bp 基对 血清白蛋白 辛可宁酸、二羟基而喹啉 碳酸二乙酯 乙二胺四乙酸 丙基 二烷基磺酸钠 读框 合酶链式反应 磷酸 白质结构数据库 NA 涉 链 干扰 导沉默复合物 达框架 片段发夹 国农业科学院 博 士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪论 囊尾蚴病的诊断和防治 研究进展 囊尾蚴病概述 猪带绦虫病（ 一种广 泛分布的人畜共患寄生虫病，病原体必须通过人和兽两种畜主才能完成其生活史，所以它和牛带绦虫病 又 称为真性人畜共患病（ 猪带绦虫病是由 猪带绦虫（ 名有钩绦虫、链状带绦虫、猪肉绦虫，寄生于人体小肠内所引起的肠道寄生虫病， 1855年 次通过人工感染试验 阐明了猪带绦虫的生活史。猪带绦虫的幼虫为猪囊尾蚴（ 名猪囊虫，主要寄生于猪和野猪等中间畜主的肌肉以及一些 组织 器官内，引起猪囊尾蚴病（ (ii et 2006)，世界动物卫生组织 )将该病列为 。 目前，该病广泛存在于发展中国家，不仅严重地影响着养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康。因此， 1993 年 世界 卫生组织将猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一 (et 2006; et 2006)。人也可以感染猪囊尾蚴，主要原因是猪带绦虫虫卵污染了食物造成感染，同时猪带绦虫患者体内的虫体脱落孕节或虫卵在患者呕吐或肠道逆蠕动时可随消化内容物进入胃，经胃液消化作用后再返回小肠，此时人就成了中间畜主 (郑 福英 等 , 2003)。 猪 囊尾蚴 感染人时 多寄生于患者的眼睛、大脑和皮下 组织 等部位 (et 2005)，也有报道在一男性患者的唾液腺检出有囊尾蚴寄生 (et 2007)。囊尾蚴在患者体内 寄生 的部位不同产生的危害情况也不同， 可导致肌肉酸痛、无力 、发胀 、视力障碍（ 甚至导致失明 )，严重的可引起癫痫、 失语、昏迷、甚至死亡。猪囊虫对猪的危害主要是妨碍猪的 生长 和 发育 ，特别 是影响幼龄猪的生长。中、轻度感染囊尾蚴 的 病猪一般无明显症状，严重感染时 多表现 为营养不良、生长发育停滞、贫血或局部出现水肿。囊尾蚴 寄生在舌部会引起麻痹影响采食 ， 寄生脑部则会引起严重的神经紊乱、癫痫、视觉障碍。 猪囊尾蚴病流行范围很广，呈世界性分布，除因宗教信仰而禁食猪肉的国家和民族外，世界各地均有本病发生。本病主要以发展中国家多见，尤以不发达地区为主，中非、南非、拉丁美洲和南亚地区发病率 较高，前苏联与东欧各国和印度等国家以往均有本病发生 (ii et 2006)。 1999 年 行 的世界囊虫病调查 结果 显示，全球大概有 250 万绦虫病患者，至少 2000万囊虫病患者 (et 1999)。 2003 年 调查 结果 显示，每年死于脑囊虫病的患者最少在 5 万人以上 (et 2003)。 我国囊虫病的流行和分布相当广泛， 1988 年 1992 年全国人体寄生虫病分布调查中，有 27个省的 627 个县有囊虫病例。许隆祺等对收集到的全国各地人体寄生虫分布调查以及有关医院收治的囊虫病 例 16508 份 进行分析，病人分布在 29 个省 (自治区、市 )的 671 个县 (市 )中 (许隆祺中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 绪 论 2 等 ,1999)。据最近各地的食品公司调查 结果 显示，猪囊虫 病在我国的 31 个省 (自治区、市 )发生和流行，东北、华北、西北、西南地区发病率较高，多为散发，但病例较为常见，在有吃生猪肉习惯的云南西部和南部地区呈地方性流行 (郑福英 等 , 2003)。 20 世纪 70 年代初， 我国部分地区猪体囊虫的检出率达 10 20 ，随着驱绦灭囊工作的开展，猪体囊虫的检出率逐年降低。 90 年代初，已降至 1 3 左右，但个别省区下降较慢。公茂庆等报道，我国屠宰场在屠宰中检出 的 囊虫病猪数量是惊人的，一般为 1 5 ，有的甚至高达 10 。 1980 年全国食品公司 屠宰后 共检出 110万头 囊虫猪 ； 1990 年，黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古 4 省区因囊虫病造成的经济损失达 元，河南省损失 元 (公茂庆 等 ,1997)。据农业部 1992 年的统计显示，全国约有 1000 万头猪感染囊尾蚴，每年因此而造成的经济损失达 20 亿，给我国的养殖业和对外贸易造成了巨大的损失。我国非常重视囊虫病的危害，在诊断和预防上都投入了大量的人力和财力，新型诊断试剂、诊断方法的研究也取得了很大的进展。在传统全囊抗原的基础上运用分子生物学的手段和方法，开展了重组基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和组织细胞苗的研发和应用，取得了重大的成 果 。 虫病的诊断 人囊尾蚴病的诊断一般比较困难，对于囊虫病患者询问病史有一定意义 ，眼 囊尾蚴病用眼病镜检查易于发现， 对于脑和深部组织的囊尾蚴可用 X 射 线、 B 超、 影像仪器检查 ，并可结合其它临床症状如癫痫、颅 内 压增高和精神症状等确诊。 采用核磁共振 技术可进一步提高诊断率，同时这些诊断方法也存 在 许多缺点 (et 2000)。猪囊尾蚴病多不表现临床症状，目前，该病的检查 方法有舌检查法和免疫学检查法。前者仅适用于舌上寄生 (27% 30%)的病猪，后者包括皮内变态反应、炭粒凝集试验、间接红细胞凝集试验、补体结合反应、琼脂扩散试验、免疫电泳和酶联免疫吸附试验 ( (顾有方 等 ,1998)。 囊尾蚴病的免疫诊 断方法 常规的猪囊虫 病 免疫诊断方法主要 有 以下几类：间接凝集试验、补体结合反应、沉淀反应和酶免疫技术。间接凝集试验即利用某些与免疫反应无关的均一小颗粒将可溶性抗原 (或抗体 )吸附于其表面， 与 相关抗体 (或抗原 )反应时，在有电解质存在的适宜条件下即发生凝集现象。碳凝集反应（ 间接血凝试验（ 卡红凝集试验和反向间接血凝试验都属于间接凝集试验的方法。补体结合反应是一种很早就应用于囊虫病诊断的基础免疫试验，但由于假阳性率太高而逐步被别的方法所取代。沉淀反应即可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质 存在 时，常 形成肉眼可见的白色沉淀物。沉淀反 应分液相沉淀 反应 和固相沉淀反应，液相沉淀反应最常用的是环状沉淀反应；固相沉淀反应包括琼脂扩散试验和将 琼脂扩散试验与电泳技术相结 合的对流免疫电泳等，但沉淀反应在囊虫病的诊断中存在检出率太低的缺点 。酶免疫技术 (目前最可靠的一种猪囊虫免疫检测技术，早期建立的酶联免疫吸附试验广泛地应 用在猪囊虫病的诊断上，在此基础上又发展了斑点酶联免疫吸附试验、生物素亲和素酶联免疫吸附试验、抑制性酶联免疫吸附试验等。此外采用酶联免疫原理和胶体金层析技术制备的囊虫病快速诊断金标试纸条技术也取得 了重大进中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 绪 论 3 展 (杆小仙 等 ,2006; 唐雨德 等 ,2003; 刘玉冰 等， 2002)。 唐雨德用抗囊虫单抗标记胶体金从而制备出金标试纸条 ， 检测血清中的囊虫循环抗原，该诊断方法法不仅操作更为简便、快速，整个检测过程只需数分钟，而且检测试剂的制备更简单，稳定性更好，很适合于基层对 囊虫病 诊断 的要求 (唐雨德 等 ,2004)。 囊尾蚴病的诊断抗原 在 猪 囊虫病 免疫诊断 过程中，按检测对象的不同可分为抗原或 抗体的诊断。抗体在畜主体内的 维持存在一个持续期，寄生虫从畜主体内排出后其抗体 的检测还可能呈阳性结果，抗原的检测特别是一些寄生虫 循环分泌抗原的诊断却更能真实地反映出宿 主的感染状况 (郝建华 等 , 1994)。免疫抗原的特异性将直接影响到诊断的效果，囊虫病免疫诊断抗原 有猪囊尾蚴全囊抗原、头节囊壁混合抗原、囊液抗原等 ,全囊和囊液抗原具有较高的诊断价值。杨毅梅用猪囊尾蚴全囊及囊液抗原作为 断抗原 ,检测血清 中 囊虫抗体的敏感性无显著 差异 (杨毅梅 等 ,2004),而头节抗原、囊壁抗原、头节囊壁混合抗原较前两种抗原的敏感性差，表明囊虫的有效抗原成分可能主要存在于囊液中 (et 1998)。 囊液抗原是猪囊虫病 诊断抗原研究的热点 ， 囊尾蚴囊液中糖蛋白分子质量为 26中 以 小分子 量糖蛋白的研究报道居 多。 等 证实 囊液中分子质量为 3064多肽具有抗原性 ， 其中约有 65%的成分与糖蛋白的结果相符合。 1989 年 ， 以刀豆素亲和层析所得的猪囊尾蚴糖蛋白建立了 在对感染有两个以上包囊的囊尾蚴病人诊断中 ，特异性为 100%， 敏感性为 98%， 并且该方法是自 1995 年以来 ， 惟一一种被世界卫生组织和囊尾蚴病诊断泛美洲健康组织所认可的免疫学诊 断方法 (石团员 等 ,2005)。 除了囊液抗原外 ， 头节 、 囊壁抗原也广泛应用于囊虫病的诊断 。 据国内外研究报道 ， 猪囊尾蚴头节和囊壁抗原成分以 B 抗原最为常见。 B 抗原是由囊尾蚴体壁细胞产生并分泌到虫体外的一种蛋白质 ， 它由分子质量为 105 95种亚基组成 ， 该抗原可通过抑制补体激活途径 ， 在囊尾蚴与宿主的免疫作用中对虫体起 保护作用 (, 1995)。 等以 抗原 进行 ， 阳性检出率分别为 80%和 90%。但 抗原 作为诊断抗原与细粒棘球蚴、细颈囊尾蚴等带科绦虫甚至血吸虫间存在 广泛的交叉反应 (D et 2003)。 囊尾蚴循环抗原和排泄分泌抗原也是十分理想的诊断抗原。寄生虫循环抗原 (虫体排泄到宿主体内的寄生虫排泄分泌物或脱落物 ,具有抗原性 ,存在于各种组织内 ,因其体内含量能客观的反映宿主的虫体感染量。血液中循环抗原早于循环抗体出现于宿主体内 ,所以 ,近年来 ,检测血液中的循环抗原作为寄生虫病早期诊断和考核治疗效果 的理想方法 ,已成功应用于旋毛虫病、血吸虫病和丝虫病 ,在猪囊尾蚴病的应用尚在进一步研究中。翟春生等应用抗夹心法检测囊