【毕业学位论文】（Word原稿）禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白p27基因的克隆、表达及免疫学诊断方法的建立硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白 达及免疫学诊断方法的建立 of of 摘 要 禽白血病 (由 禽白血病 /肉瘤病毒群病毒 (L/引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。 本 病在世界各地均有发生，感染率高，发病率 低，是危害养禽业的主要疾病之一。 流行病学调查研究表明，本病在 我国也 广泛的 发生 和流行 。 由于目前尚没有有效的疫苗和药物用于防治本病，世界各国控制禽白血病的主要措施是通过病原检测，淘汰阳性鸡，从而 净化种群达到消灭本病的目的 ， 因此建立一种 快速准确 的诊断方法 就显得尤为重要。 迄今为止， 国内外相继建立了多种禽白血病诊断方法，但其试剂制备和诊断过程均有不足之处。 壳蛋白 一种高度保守的非糖基化蛋白，在外源性 A、 B、 C、 D、 J）各亚群间同源性高达 90%，是 要的群特异性抗原，且在病毒蛋白中含量最高 ，是禽白血病抗原检测的理想靶蛋白。 本研究的目的是利用分子生物学技术克隆 禽白血病 衣壳蛋白 因，对 因进行原核和真核表达，为进一步研制快速准确、灵敏特异的抗原和抗体检测方法奠定基础。 从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒 ( 胚成纤维细胞（ 养物中提取用 因的特异性引物，通过 法扩增出 720 因片段；将该片断克隆至 体，酶切鉴定后进行序列测定和分析，表明该片段的核苷酸序列与国外离株（ 的同 源性达 将 因亚克隆至原核表达载体 化受体菌 导表达，获得大小为 56可溶性融合蛋白，薄层扫描分析重组蛋白占菌体总蛋白的 23%； 纯化获得的 重组 白具有良好的抗原反应活性，可代替全病毒用于间接 断方法的建立。 相比于 通过提纯病毒，去污剂裂解，电泳纯化 白 的 传统方法，利用原核表达系统制备重组 白 成本低，纯度高，周期短。 对原核表达的重组 白用亲和 层析 法纯化后，免疫实验兔制备了抗血清，进而建立了 琼脂扩散 诊断方法，该方法简便 、特异，可以满足现地使用的需要。 在原核表达的基础上， 利用 状病毒表达系统 对 白进行真核表达，所表达的产物能与全病毒制备的抗血清发生特异性反应。 相比于原核表达系统，杆状病毒表达系统表达 的蛋白具有与天然蛋白更相似的结构和功能，为下一步 利用重组蛋白直接制备单克隆抗体创造了条件。单克隆抗体的研制为结合上述制备的 白多克隆抗体，建立一种简便快捷、适用于大面积推广的禽白血病 /肉瘤病毒群抗原检测 的 双抗夹心 造了条件 ， 必将 为 我国 禽白血病的种群净化提供技术支持。 此外， 表达 一步结合表达 感染昆虫细胞有望形成 疫苗的研制开创新的思路。 关键词： 禽白血病劳斯肉瘤病毒； 因；克隆；表达；多克隆抗体；琼脂扩散试验； is a by LV is in in of in of is L AL is or up to AL by LV to of of on of of of of a to At LV by in is in of an 0% LV , B, C, D, J. is LV in to LV in to a LV as EF of a 6kD of 3% of at B of an be as LV in of of is of An as to LV in of a in f9 of to in as be on a be to be LV in a of be to LV In LV in LV in to be to I 目 录 引 言 . . .、 禽白血病病毒概述 . 分类地位及其亚群 . . 形态及其基因组结构 . . 因和 白质 2 4. 毒囊膜基因及受体 . 2 5. 外源性病毒和内源性病毒 . 3 6. 原漂移 . 4 7. 流行病学特点 . 4 8. 致病性及其致瘤机制 5 9. 免疫抑制 . 6 二、禽白血病的诊断及种群净化 . 诊断方法及比较 . . 内源性病毒和外源性病毒的鉴别诊断 8 3. 禽 白血病的种群净 化 、 本实验的目的和意义 9 研究报告 验一 禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白 因的克隆、序列分析及 原核表达 11 1. 材料与方法 . 结 果 . 讨 论 验二 组蛋白的纯化、多克隆抗体的制备及在诊断中的初步应用 20 1. 材料与方法 . 结 果 . 讨 论 验三 利用 状病毒表达系统快速生成 . 材料与方法 . 结 果 . 讨 论 论 考文献 谢 者 简历 国农业科学院硕士学位论文 引 言 1 引 言 禽白血病 (由禽白血病 /肉瘤病毒群病毒 (L/起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。根据临床症状可分为淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞白血病、髓细胞样白血病、结缔组织性肿瘤和骨硬化病等，其中以淋巴白血病最为常见。本病在世界各地均有发生，感染率高，发病率低，是危害 养禽业的主要疾病之一。鸡群一旦发生此病，一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是产生非肿瘤综合征，主要表现为生产指标发生变化，如性成熟推迟，母鸡产蛋率下降，蛋重下降，受精率下降和孵化率下降等；更严重的是它可引起鸡的免疫抑制，继发其它的细菌和病毒感染，造成严重的经济损失。 1997 和 1998 年，J 亚群禽白血病在世界范围内的大 暴 发，给养禽业造成了巨大的经济损失 (N.， 1998； 李增光 ， 2000； 刘公平等 ， 2000)。但至今，人类对禽白血病的防治还无计可施，既没有疫苗可以利用，也没有有效的药物用于治疗，控制禽 白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，净化种群，从而达到消灭本病的目的 （ S et 1998； 1997； 张冰等 ， 2002） 。因此， 建立一种成本低 、快速准确、适用于大量检测的诊断技术显得尤为重要，研制一种行之有效的疫苗成为防治禽白血病的当务之急。 一、 禽白血病病毒概述 1. 分类地位及其亚群 禽白血病病毒属反转录病毒科，禽 C 型反转录病毒属，禽白血病 /肉瘤病毒群。该病毒的主要宿主是鸡，根据病毒中和反应形式，宿主范围，囊膜特性，将 为 AJ 10 个亚群 ， 其中 A、 B、 C、 D 为外源性病毒， E、 F、 G、 H、 I 为内源性病毒。在 20 世纪 60 年代 ， 人们发现 A、B、 C、 D 和内源性的 E 亚群 鸡易感的。其中 A 亚群被认为是商品产蛋鸡群中来航鸡最为普遍感染的外源性病毒，其次是 B 亚群， C、 D 亚群几乎很少发生，无致瘤性的 E 亚群无处不在， 它以内源性的前病毒形式存在。近年来，世界上各发达国家的商品鸡群中已基本上消灭了这类经典的外源性 感染，然而 1988 年 从肉用仔鸡中分离出一种新型的禽白血病病毒亚群 (群 )，据推测 可能是内 源性病毒 囊膜 基因 (其他外源性 重组体 （ N.， 1998） ， 它不属于鸡 知的 A、 B、 C、 D、 E 亚群中的任何一种，被单独命名为 群。 2. 形态及其基因组结构 毒粒子直径 80 100外部的囊膜和内部电子致密的核心构成，核心直径 45毒囊膜上有放射状突起，直径约为 8图 1)。 基因组是 两分子的 单股、正链、线性成 的二聚体，单体长为 7 11占病毒干重的 2%。病毒粒子中的 具有感染性，两分子的 各自的 5端 通过氢键相连接。一分子的基因组 与一分子特异的来源于宿主的 连，成为病毒 转录过程中生成 引物。其基因组 体中国农业科学院硕士学位论文 引 言 2 的结构与真核细胞的 似， 5端为甲基化的帽子结构， 3端为 )的尾巴。 因组的两端为非编码区，中间部分为编码区，编码区有 3 个结构基因 ， 从 5到 3依次为 别编码病毒的核心蛋白，酶蛋白和囊膜糖蛋白 (见图 2)， 毒粒子中的蛋白质含量约占病毒干重的 60%。结构基因两侧的长末端序列 (与病毒 复制和翻译有关。全基因型的白细胞增生病病毒，除有上述基因外，还有多种调节基因如 ， 在 因下游有致瘤基因 陷型病毒基因组缺失部分或大部分结构基因，均缺失 因，多数病毒缺失全部 因， 因发生部分缺失或不缺失。结构基因的缺失处由同源性较低、名称各异的致瘤基因所取代。 3. 因与衣壳蛋白 因核苷酸序列高度保守， A、 B、 C、 D 亚群和新近发现的 J 亚群同源性在 96%以上，编码群特异性抗原 ( 因 先 编码一个 76， 000 道尔顿的非糖基化前体蛋白 ( 然后 被病毒蛋白酶 (割成小蛋白，其顺序为 中 基酸序列高度保守，位于病毒的表面，与病毒的穿膜糖蛋白相连，与病毒芽生有关 （ et 2001） 。 22 个氨基酸的短肽，其功能不祥，但是，去除大部分 抑制病毒粒子的形成。 于病毒囊膜和核心之间，参与病毒后期装配和早期感染。在 白中， 不保守， 与 比，有 15 个碱基发生了突变，导致 8 个氨基酸变异。 主要的群特异性抗原，有许多易于检测的病毒抗原位点， 白基因十分相似，有 13 个碱基不同，导致 3 个氨基酸不同。 9 个氨基酸的多肽，连接 功能不详。编码 基因相当保守， 序列完全相同。核衣壳蛋白 碱性蛋白，与基因组 密结合，基因序列也相当保守。蛋白酶 作用是在装配时，对 因产生的多聚蛋白进行切割，产生成熟的 白质。此外， 端的 7 个氨基酸组成的区域还有增加病毒的装配效率的作用。 4. 毒囊膜基因及受体 病毒囊膜基因 (因 )极易发生变异， A、 B、 C、 D 亚群和新近发现的 J 亚群同源性仅有40%（ 刘公平 ， 2001； N， 1992） ，编码病毒的囊膜糖 蛋白 个结构，两者由二硫键相连成二连体。其中 责识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，称为外膜蛋白 (，能刺激机体产生中和抗体，它决定了病毒的亚群特异性； 责将病毒转入细胞，称为穿膜蛋白 ( A E 各亚群病毒囊膜基因序列的差异主要在 的 3 个可变区 ( 宿主范围决定簇区 ( J 亚群的 的核苷酸序列与 A E 亚群病毒不同 （ N et 1991） 。对 亚群病毒囊膜基因的变异、进化关系及其生物学意义了解甚少。通过交叉中和试验发现， A 亚群各病毒密切相关，较为保守 ;J 亚群 膜基因通过与内源性病毒相同序列重组而获得，囊膜基因产物对所诱导的疾病类型无影响。尽管病毒可以非特异吸附到细胞表面，但病毒最终能否进入细胞则是由靶细胞膜上是否有病毒特异性受体决定。通过不同遗传背景细胞对不同亚群病毒的易感性分析，推测在鸡的基因组中有 个常染色体基因座，它们分别独立控制中国农业科学院硕士学位论文 引 言 3 着 A 亚群、 B 与 D 亚群、 C 亚群和 E 亚群病毒的易感性（ B et 2001； M et 003） 。在每种 点上，存在着易感和抵抗等位基因，而易感基因属显性基因 ， 因此，只有当细胞处于抵抗基因纯合状态时才能完全抵抗某亚群病毒的感染。尚不清楚鸡对 J 亚群病毒的遗传抗性，似乎所有品系鸡对 J 群病毒都易感。最近已先后分离到 A、 B 和 E 亚群病毒受体基因。从鸡和鹌鹑的细胞中克隆出的 A 亚群病毒受体基因产物属低密度脂蛋白受体 (家族中的一个成员，目前通过点突变法已确定了受体蛋白中功能较为重要的几个氨基酸残基，受体基因在 Y， 2002； et 2002） ；从鸡细胞中克隆出的 家族中的一员，在该受体蛋白的胞浆中有一个与 I 型 人相似的 死亡域 ，可以诱导细胞凋亡，这与 B、 D 亚群病毒感染细胞后会引起细胞死亡的现象相吻合（ B et 2001； M et 2003） ；从火鸡细胞中克隆出的 E 亚群病毒受体基因与 B 亚群病毒受体基因序列十分相似，可使细胞对 E 亚群病毒易感，但对 B 亚群病毒不易。 5. 外源性病毒和内源性病毒 根据自然传播方式的不同，可将 为外源性和内源性病毒。两种病毒的主要差别在于的序列不同。外源性病毒是以感染性病毒粒子的形式进行传播，是全基因型的病毒粒子，或者是缺陷型病毒基因组和辅助病毒囊膜组成的伪型，病毒既能垂直传播也能水平传播，如 A、 1 毒粒子结构示意图 he LV 合酶 衣壳蛋白 表面蛋白 基质蛋白 穿膜蛋白 反转录酶 囊 膜 图 2 因组结构示意图 he LV g a g p o l e n v g a g p o l e n v 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 4 B、 C、 D 和 J 亚群病毒。内源性病毒 (指正常鸡基因组中与外源性 因组十分相似的结构元件，一般不以病毒粒子的形式进行传播，只作为鸡基因组的一部分按孟德尔遗传规律进行代次间传递。目前已知有几个内源性病毒家族，包含各类 因座的 族、中度重复元件 族和高度重复序列元件 族 （ F et 1998；刘公平等 ， 2001）， 这些元件的起源、进化关系和生物学意义尚不明了。从进化论角度分析， 为古老， 件最为年轻。生物中广 泛存在与其基因迁移有关的各种反元件 (反座子和反转座子，它们是反转录病毒的进化前体，已经获得了作为传染性实体存在于细胞外的能力。有人认为内源性病毒可能是在长期进化中整合进生殖细胞系的外源性病毒。大多数内源性病毒都是遗传缺陷性的，不具备产生感染性病毒粒子所必需的反转录聚合酶基因，但是有些元件可产生 E 亚群 子， 如代表株 所有的内源性病毒元件中研究较多的是 因座家族中各成员，常采用限制性内切酶酶切片段长度多态性 (析来鉴定，至今已鉴定的鸡 因座有 29 个，估计共有 50 100 个 因座，每只鸡平均携带 5 个 （ et 2003） 。由于病毒 因的存在和未知的控制机理，各基因座的表型有很大差异。如 因结构完整，自发或经化学诱导剂诱导在细胞中产生 E 亚群白血病病毒粒子；缺陷性 因在细胞内也可进行表达，但不产生具有感染性的病毒粒子；如 因座带有 因，其寄主细胞含有 原和 E 亚群病毒的囊膜糖蛋白，但 接有缺失而不产生完整的病毒粒子。 因座的表达产物可通过 接补体结合试验 (鸡辅助因子 (验来测定。 因表达产生的囊膜糖蛋白可阻断细胞表面的细胞受体，使细胞对E 亚群病毒失去易感性。 因从父母代向子代的传播称为遗传性传播，完全表达的具有感染性的病毒粒子也可进行垂直传播和水平传播 （ .M et 1997） 。 E 亚群 表株 致肿瘤能力很弱或根本无致瘤能力。关于 因座对鸡只的危害目前还没有统一的结论，但可以肯定的是， 因座不是鸡生长发育所必需的。 6. 原漂移 为反转录病毒科的一员，具有的显著特征是其基因的不稳 定性和多样性，这是由于因编码聚合酶的高序列出错率和基因的高重组率造成的（ 1996），加上宿主的免疫选择压力，使得 抗原变动性极高（ 2000）。 群特异性是由编码病毒囊膜蛋白基因区的 3 个可变区 ( 2 个宿主范围决定簇区 (守序列共同决定的 。尽管 群分类的标准之一是 交叉中和反应，但事实上 一毒株的中和抗体并不能中和大多数该亚群的毒株，如 和抗体并不能中和大多数已分离的 J 亚群毒株。 998)利用 列设计的特异性引物 198 个 J 亚群毒株进行扩增，仅有 16 株得到了阳性结果。 他 1998 鉴定的 12 株 J 亚群毒株进行 列分析，它们与原型株的同源性达 突变主要集中在 然而正是这些变异导致和抗体不能中和其中的部分毒株。 7. 流行病学特点 禽白血病在世界各地均有发生，成世界性分布，地方性流行，具有感染率高、发病率低的特点，是危害养禽业的主要疾病之一 （ 潘如芳等 ， 1997； 李新华 ， 1997）。 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 5 播 外源性禽白血病病毒有两种传播途径，经蛋从亲代向后代垂直传播和通过直接或间接接触在禽类之间水平传播，其中垂直传播是主要的传播方式，它足以使病毒代代相传，而水平传播又保证了垂直传播得以维持，尤其是濒死禽通过水平传播使垂直传播有了充分的传染源。内源性 数内源性 遗传缺陷型，不能产生感染性病毒粒子；但有些也可在鸡胚和孵出的雏鸡体内形成感染性病毒粒子，然后以与外源性病毒相似的方式传播，但多数鸡对这种外源性感染具有遗传抵抗性。 染特征 公鸡和母鸡对 易感染，母鸡在本病的流行中起主要作用，而公鸡仅起次要作用，不影响对后代的先天感染的速率。 在精细胞中繁殖，公鸡只是病毒的携带者，通过接触和性交配成为感染其它禽类的传染源。感染禽白血病的鸡存在三种血清学类型：即无病毒血症，有抗体 (；有病毒血症，无抗体（ V+有病毒血症，有抗体 (V+A+)。 行特点 泛分布于雏鸡体内，雏鸡感染后不一定全部发病，如部分鸡对病毒存在有遗传抵抗性，即使感染，发病也较少，感染鸡会成为病毒携带者和传播者，其发病率与感染日 龄相关，感染愈早，发病率愈高；而部分鸡会产生免疫耐受形成保毒鸡，其发病率、死亡率比其它有抗体鸡群要高。这说明感染了 鸡不一定发病，没有发病的鸡不等于没有感染 群发病死亡常在鸡只性成熟开产之后，剖解可见多种器官有肿瘤。能引起免疫抑制的疾病如马立克氏病，鸡传染性贫血等均能增加 播 ( T， M ， 1994)。 8. 致病性及其致瘤机制 禽白血病病毒感染细胞后，多数情况下不会对细胞造成损害，而成为隐性感染。但一些特殊情况下或某些种类的禽白血病病毒感染能导致 细胞转化或引起细胞病变。根据其转化细胞的快慢，可将 为 2 类，即急性转化型 慢性转化型 者转化细胞的机制不同。 急性转化型 论在体外还是在体内，均能在几天之内转化细胞。急性转化型 禽成红细胞性白血病病毒和成髓细胞性白血病病毒 )转化细胞的分子基础是其基因组中携带 1 个或 2个位置不定的病毒性肿瘤基因 ( et 1995)，它们可能是在长期的进化过程中通过遗传重组从正常细胞获得，不受正常调控过程控制。肿瘤基因的异常表达产物使细胞生长和分化发生变化而产生肿瘤，主要分为 4 类 即生长因子、生长因子受体、核因子和转录因子。 携带有 瘤基因，编码转录因子，诱导骨髓单核细胞肿瘤； 病毒带有 码转录调控子，诱导成髓细胞和前髓细胞肿瘤 ;禽成红细胞性白血病病毒 ( 因产物为表皮生长因子受体，诱导成红细胞性白血病 ;毒带有 因转化靶干细胞， 因产生骨髓单核细胞生长因子，诱导骨髓单核干细胞肿瘤； 带有 带有 因编码转录因子。目前已鉴定的禽类病毒性肿瘤基因有 15 种 (， 1995)。 慢性转化型 病毒性肿瘤基因，感染后形成肿瘤较晚，这些病毒基因整合在宿主细胞基因组中原癌基因的上游、下游或中间，引起插入突变来诱导淋巴细胞性白血病。多能干细胞的原癌基因被 的启动子或增强子激活，导致细胞肿瘤基因的异常表达而形成肿瘤， 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 6 列差异和特异性的 合蛋白决定了转化细胞的类型。慢性转化型 导的最常见的肿瘤是 B 淋巴细胞瘤，其中 B 淋巴细胞 因被异常激活，产生大量的 62000蛋白，导致B 淋巴细胞的转化与恶性增生，形成 B 淋巴细胞瘤，同时伴有其他细胞性肿瘤基因的激活导致肿瘤进行性生长与转移。增生性 B 细胞的分化停滞在 生阶段， 染后数周法氏囊有一个或多个转化的淋巴滤泡再迁移到其他器官导致鸡只死亡 (， 1994)。在野外和实验室条件下都发现马立克氏病病毒 (苗株可增加淋巴性白血病的发生率，其原因是 物可反式激活 M et 1993； T et 1994） 。最近英国分离的 无致瘤基因，但也能诱导骨髓细胞性白血病，可能是插入突变引起肿瘤发生 （ ， 1995)。对这些无致瘤基因的病毒株致瘤机制的研究，有望为人类控制和预防癌症提供借鉴。 9. 免疫抑制 免疫抑制是指由于各种因素影响，使得机体对抗原的应答能力低下甚至缺失的现象。造成免疫抑制的因素有很多，包括疾病、应激、营养等。其中病毒感染引起的免疫抑制尤为严重，人类的获得性免疫缺陷综合症就是由病毒引起免疫抑制的典型代表。在禽类，也有许多的免疫抑制性疾病，禽白血病是其中的一种。这些疾病有时单独感染 不表现明显的临床症状，但由于引起免疫抑制使机体免疫力低下，从而导致机体对多种致病因子易感性增强及疫苗免疫失败，从而引发一系列恶性后果，给养禽业造成巨大的损失。 经典型 天然靶细胞是 B 淋巴细胞， 染后，可使 B 淋巴细胞发生转化，形成肿瘤细胞并不断增生，转化的 B 淋巴细胞失去了产生 能力；而 喜好的是髓细胞，正常的骨髓干细胞在 用下，发生增生恶变，形成骨髓瘤；淋巴器官和骨髓变性，导致功能性 合成受到干扰，影响到 T、 B 淋巴细胞的成熟及分化，从而导致了免疫抑制 （ 韦平，2002； 马秀丽， 2000） 。 二、 禽白血病的诊断及种群净化 至今，人类对禽白血病的防治几乎还无计可施，即没有疫苗可以利用，也没有有效的药物用于治疗， 世界各国控制禽白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，从而 净化种群达到消灭本病的目的 。因此， 在该病的控制中 及时准确的诊断 就显得尤为重要 。国内外相继建立了多种禽白血病 诊断 方法，但每一种诊断技术均有利弊，对禽白血病的确诊往往需要利用多种检测技术的多次随机检测才能作出。 1. 诊断方法及比较 毒的分离与鉴定 病毒分离鉴定是诊断禽白血病最为有效、可靠的技术。用 于病毒分离的理想材料为血浆、粪便、蛋清、胚胎、精液、和羽髓。将被检材料经适当处理后，接种于单层的 C/E 鸡胚成纤维细胞（ 行培养， 在 增殖，但不形成明显的细胞病变 (用抗原捕捉 阳性结果表明存在外源性禽白血病病毒。 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 7 病毒分离检测技术最大的缺点是费时、昂贵，不易对大量样品进行检测。即使在最适宜条件下，从取样到出结果至少需要 10 天。此外，即使病毒分离技术可以方便的应用于诊断鸡只的感染，也很难确保鸡体内不存在有潜伏感染的病毒，更不能排除鸡只发生再感染的可 能。 抗夹心 抗夹心 测技术的优点是廉价、快速，适用于包括卵蛋白、阴道分泌物、胎粪、泄殖腔棉拭子等多种样品的检测。 1979 年， 经用兔抗禽白血病衣壳蛋白 立了检测 原 的双抗夹心 。目前， 原诊断试剂盒在国外已实现商品化，我国也曾进行了相关的研究，但至今 断试剂盒尚未问世。 这种检测技术最大的缺点是检测结果常出现假阳性 ， 因为双抗夹心 检测该病毒的一种蛋白质 用该技术检测出的阳性结果仅能说明待检样品中含 有 内源性病毒和外源性病毒中均属保守的一种蛋白质，利用双抗夹心 检测出的阳性结果并不能证实这种蛋白来源于外源性病毒。因此，在检测外源性病毒时常出现一定数量的假阳性结果。正因为如上所述的缺点，人们对双抗夹心 测技术仍有很大争议。在应用双抗夹心 测