生物化学技术1 生命大分子物质的制备.ppt

第一章生命大分子物质的制备,生命大分子物质,是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称,蛋白质和核酸类物质是本学科的主要研究对象，而它们往往与其他物质结合在一起，或蛋白质和核酸相互组合而一起出现，加之它们含量低、离体后稳定性较差，使得提取分离过程变得困难；尽管如此，制备生命大分子物质的程序还是存在不少共同之处,目的,掌握材料的选择与处理及确立测定方法掌握细胞的破碎、抽提、浓缩熟悉纯化方案的设计与评价,第一节材料的选择与处理,一、材料的选择,是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质,有效成分的定义,生物材料的特点,有效成分含量一般较低有效成分稳定性较差选用的材料不同，有效成分的含量就不同；即使选用的材料相同，不同的部位和生长时期，其有效成分的含量也不尽相同,材料选择原则,有效成分含量高，稳定性好材料来源丰富，保持新鲜提取工艺简单有综合利用价值实际工作中，不能硬套原则，要视实际情况而定,二、材料的处理,对于生物材料，应及时使用，否则有效成分会部分甚至全部被破坏，影响得率若处理不当，会严重影响有效成分的产量和质量,（一）动物脏器,冰冻：去除脂肪和筋皮等非有效部位，-10或-70冰冻储存,干燥：小量（如垂体等小组织）可用丙酮脱水干燥对于耐高温的有效成分（肝素），其材料可用沸水蒸煮处理，烘干后保存,除脂方法,人工剥离用脂溶性有机溶剂脱脂热处理冷藏法（速热到50左右，然后速冷却），使其结块而除去运用油脂分离器分离,（二）植物组织,茎叶等洗净即可使用，或快速放置-430储藏备用；若为种子，则需泡胀或粉碎才使用（油脂较多的也需脱脂处理）,（三）微生物,由于具有种类多、繁殖快、培养简单、诱变容易和不受季节影响等优点，现已成为制备生命大分子物质的主要材料之一上清：制备胞外酶和辅基等成分培养液离心菌体：破壁后提取胞内成分,第二节确立测定方法,一、目的要求,目的：1.确定生物材料2.确定提取纯化方法的有效性,要求：方法简单、灵敏、专一性强（因为抽提液和纯化的前阶段溶液中有效成分的比活低而杂质的种类多且含量高）,常用的测定方法,光谱法：包括吸收光谱法、荧光法、浊度法,电化学法,生物活性检测法,免疫分析法,生物传感器,（一）光谱法,特点：所需样品量少，操作简单，反应迅速，灵敏（10-7）。广泛用于蛋白质含量的测定,1.吸收光谱法,直接测定：将待测物配成一定浓度的溶液，在一定波长处用分光光度计测定其含量如测定核酸含量：双链DNA：50g/ml；单链DNA：g/ml；单链NA：g/ml；A260=1纯度测定:纯DNAA260/A280=1.8;纯RNAA260/A280=2.0(若DNAA260/A2801.8或2.0,说明有蛋白质混入),比色法:将待测物与相关试剂或酶的底物作用产生具有特定颜色的物质,通过测定有色物质的A值对待测物定量或测定酶的活性,2.荧光法,特点：精确、灵敏（10-9-10）、重复性好,如AST的测定：ASP+-酮戊二酸草酰乙酸+Glu草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+AST活力测定就是通过测定在340nm（NADH）处的A值下降量,AST,MDH,3.浊度法,主要对稀悬浮液进行测定如：半刀豆球蛋白活力测定A420培养液中细菌浓度测定A600,（二）电化学法,用pH计或酸碱滴定进行测定,（三）生物活性检测法,根据生命活性物质用于实验动物身上引起的变化对生命活性物质进行检测如：HCG能使小鼠子宫加速增殖，故通过注入HCG后检测小鼠子宫的变化来推测HCG的生物活性,（四）免疫分析法,利用Ag-Ab特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质灵敏定性或定量如：酶联免疫吸附法,（五）生物传感器,利用生物传感器的敏感膜与待测液中某一成分进行反应，来显示有效成分的数量,几种测定蛋白质和核酸含量的方法,第三节细胞的破碎,有效成分有的存在于“材料”细胞外，有的存在于细胞内。就原核细胞而言，若有效成分分泌到细胞外（如淀粉酶类、水解酶类），则分离培养液上清，用相应试剂和方法即可提取制备；若有效成分存在于细胞内（如氧化还原酶类），则需破碎细胞，再进行提取但也有例外，如从铜绿假单胞菌中提取ALP时，可不破细胞，用0.2mol/LMgCl2的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.4）或0.2mol/LMgCl2的溶液（pH8.4）进行抽提（提取酶蛋白后的细菌细胞，可继续培养）一般动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破碎，往往在组织绞碎或提取时就破坏了，而植物和微生物的细胞壁较牢固，需提前进行专门的破细胞操作,常用方法,机械破碎（研磨法、组织器捣碎法、超声波法、压榨法和冻融法）溶胀和自溶化学处理生物酶降解,一、机械破碎,1.研磨法：将剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研磨。为提高研磨效率，也可加入一定量的石英砂（注意“吸附”）。大规模生产时，可用电动研磨法（如球磨机）,此法为温和破碎，适用于动物细胞和细菌细胞的破碎,2.组织捣碎器法：捣碎器（800010000r/min）处理3045S,植物和动物细胞可完全破碎，但对微生物需加石英砂才有效；注意必须低温捣碎，以防温度升高引起有效成分变性，因此时间不宜过长剧烈方法,3.超声波法：利用超声波破碎细胞壁和细胞器的有效方法，时间一般较长，（510min或更长。为防止电器长时间运转产热，一般采用间歇处理和降温破碎法）,4.压榨法：用高压（高于1000倍以上大气压的压力）迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（孔径细胞直径），使细胞被挤破,5.冻融法：将细胞反复速冻（低温）速融（高温，如40），使细胞破碎,二、溶胀和自溶,溶胀：将细胞置低渗环境中，细胞水肿、胀裂，释出胞内溶物如：红细胞置蒸馏水中会迅速溶胀破裂而释放血红素,自溶：细胞在本身具有的水解酶（如蛋白酶、酯酶类）作用下，发生溶解的现象（如尸体的腐化）此法要注意酶对有效成分是否有分解作用,三、化学处理,运用脂溶性溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表面活性剂（如SDS等）处理细胞时，可溶解细胞壁、细胞膜的部分结构，使细胞内的酶、DNA等物质释放出来,四、生物酶降解,生物酶（如溶菌酶等）能降解细胞壁。在用此法处理细菌细胞壁时，先是细胞壁消化降解，然后由于渗透压差引起细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎如从细菌细胞中提取质粒DNA时，很多方法都是采用了加溶菌酶破壁,第四节抽提,含义：抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程,一般理想的抽提溶剂应具备下述条件对有效成分溶解度大，破坏作用小对杂质不溶解或溶解度很小来源广泛、价格低廉、操作安全等,一、抽提的含义,对不同组织抽提的具体抽提方法可参阅有关文献,二、影响抽提的因素,（一）pH值抽提溶剂pH值对有效成分的稳定性和抽提效率都有极大影响。对于两性电解质成分的提取，一般选择pH值偏离等电点的稳定范围内抽提如肝素提取时，在酸性pH范围内易受破坏，且不易与脂蛋白分离；而在碱性pH范围内，蛋白质带负电荷，不能与带强负电荷的肝素形成离子键而分离。故选择pH10.511的高碱性,注意：调抽提液pH时，一般pH用弱酸（HCL）调节说，应及时搅拌均匀，如果搅拌不均，以免局部pH过高或过低而引起所需成分变性,（二）溶剂的极性和离子强度,调节溶剂极性的方法:增加极性加蔗糖或甘油降低极性加DMSO或二甲基甲酰胺,调节离子强度：加入中性盐，如KCl、NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4等,一般，离子强度低的中性盐溶液有促进pro溶解，保护蛋白质活性的作用；离子强度过高会引起pro盐析,（三）水解酶,水解酶在生物组织中往往与蛋白质、核酸等共存。在提取分离过程中应采取适当方法抑制酶的活性；如加苯甲基磺酰氟化物（PMSF）、调节抽提液的pH、离子强度或极性等例：胰岛素的制备原理,几种蛋白酶的抑制剂,苯甲基磺酰氟化物（PMSF）在水溶液的半衰期,在抽提液中加入2-巯基乙醇(15mmol/L)或半胱氨酸(520mmol/L)、还原谷胱甘肽和巯基乙酸盐(15mmol/L)等还原剂时，就可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失,在抽提液中，酶和巯基试剂间发生如下反应：,ENZ-S-S-ENZ+RSHENZ-SH+ENZ-S-S-R,无活性酶巯基试剂活化的酶无活性酶,ENZ-S-S-R+RSHENZ-SH+R-S-S-R,（四）温度,一般认为，蛋白质、酶等生物大分子物质在低温（如0左右）条件下较稳定例：从孕妇尿中提取HCG在8以下,但此规律不是绝对的，也有的物质在相对高温条件下更稳定例：从鸟肝中提取丙酮酸羧化酶25,（五）搅拌,搅拌可促进溶剂与待提取成分的接触，并能增加溶解度；但应温和搅拌，否则容易产生泡沫，导致某些酶变性失活,（六）氧化,蛋白质分子结构中往往含有一定数量的-SH（为蛋白质或酶的必须基团），易被氧化变质失活解决方法：在抽提液中加入2-巯基乙醇、Cys、GSH、巯基乙酸盐等,另外，植物组织和微生物细胞中含有较多酚类化合物，也易被多酚氧化酶氧化成红色或棕色的醌类化合物；可通过加入10%苯基硫脲或310-3mmol/L的PVP，防止氧化,（七）金属离子,金属离子能与-SH结合成沉淀物解决办法：1.用去离子水或重蒸水配制试剂2.在配制的试剂中加入13mmol/L的EDTA,（八）抽提溶剂的用量,在抽提时，溶剂与抽提物原料要适当，一般以51为宜；如抽提物过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行,第五节浓缩,常用的浓缩方法有下面几种,沉淀法吸附法超过滤法透析法减压蒸馏法冰冻干燥法,一、沉淀法,在抽提液中加入适量中性盐，如（NH4）2SO4或有机溶剂，使有效成分沉淀经离心除去不溶物（杂质）后，上清液通过透吸、凝胶过滤等方法脱盐等,二、吸附法,用干葡聚糖凝胶G-25（或吸水棒）加入抽提液中，15混合，利用凝胶的吸水性去除抽提液中的水分（注意：若凝胶对有效成分有吸附，则不宜用此法浓缩）,三、超滤法,将抽提液装入超滤装置，在氮气或空气压力（5.05105Pa）下，使小分子物质（包括水等）通过半透膜除去，而大分子物质则留在膜内，即起到浓缩的目的，又发挥纯化的作用（如硝酸纤维素膜）,四、透析法,将装有抽提液的透吸袋（半透膜袋）埋于PEG或甘油中，利用其强亲水性吸干抽提液中的水分,五、减压蒸馏法,在减压（真空）状态下进行蒸馏。当真空度较高时，溶液沸点可控制在较低温度（如30以下）适合于常温（30）较稳定的物质的浓缩,六、冰冻干燥法,原理：利用低温真空升华原理；即是将冰冻的抽提液置抽真空的干燥器中（如P2O5、硅胶等），水从固态升华为气态并被干燥剂吸附，使抽提液浓缩,第六节纯化方案的设计与评价,纯化方案的定义,指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法（如沉淀、离子交换、凝胶过滤等）有机地互补联合形成的纯化工艺流程,一、纯化方案的设计,1、选择分离方法：,一般从抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性考虑的,2、纯化方案中各分离方法的排布原则,一般应当先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序+处理的方法，而精确、费时和需样品量少的方法，则适宜后选用,选择依据,沉淀法离子交换层析凝胶层析亲和层析电泳,从粗到精，从简到繁,二、纯化方案的评价,评价方法：对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测定，并将各自的比活力(活力单位数毫克蛋白)、纯化倍数(每步的比活力粗抽提液的比活力)和收得率(100%)计算出来。视纯化倍数的大小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值,一般认为：凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有