单个核细胞分离

1、杨 巍 比重：比重：1.0701.070比重：比重：1.0771.077 比重：比重：1.0921.092 ficolll查出四个大方格的总细胞数查出四个大方格的总细胞数( (x)x)l算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数：y=x/4y=x/4l每个大方格的体积为每个大方格的体积为v=1mmv=1mm1mm1mm0.1mm=0.1mm0.1mm=0.1mm3 3=10=10-4-4mlmll制备的细胞悬液的细胞浓度（制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=y /ml)=y 10104 4稀释倍数稀释倍数(50)(50)4淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞分离及检测技术巨噬细胞巨噬细胞淋巴细胞

2、淋巴细胞免疫细胞的分离免疫细胞的分离 免疫细胞的分离原理及方法免疫细胞的分离原理及方法 免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞的总称。的所有细胞的总称。 mononuclear phagocyte system granulocytes lymphocytesmonocytemonocytemacrophagemacrophagedendritic cells dendritic cells neutrophilsneutrophilsbasophilsbasophilseosinophilseosinophilst lymphocyte

3、t lymphocyteb lymphocyteb lymphocytenk (natural killer cells)nk (natural killer cells) 直接参与免疫应答的细胞主要为：直接参与免疫应答的细胞主要为：t细胞、细胞、b细胞、巨噬细胞细胞、巨噬细胞 一一. . 外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（pmbcpmbc）分离）分离二二. . 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性纯化淋巴细胞亚群）纯化淋巴细胞亚群）v e e花环分离法花环分离法v 尼龙纤维分离法尼龙纤维分离法v 免疫荧光法免疫荧光法v 流式细胞术流式细胞术( (

4、flow flow cytometrycytometry, fcm), fcm)v 磁珠分离术磁珠分离术免疫细胞的分离免疫细胞的分离 1.1. 细胞膜脆性：低渗液分离细胞膜脆性：低渗液分离2.2. 细胞密度：密度梯度离心法细胞密度：密度梯度离心法3. 3. 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术4. 4. 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛免疫细胞分离的依据免疫细胞分离的依据 （一）外周血单个核细胞（一）外周血单个核细胞（pbmcpbmc）的分离）的分离血中的细胞血中的细胞 单个核单个核 pbmc 无核无核 红细胞红细胞 多核

5、多核 多核白细胞多核白细胞pbmc的比重的比重1.075 红细胞红细胞多核白细胞多核白细胞平均比重平均比重1.092ficoll淋巴细胞分层液淋巴细胞分层液 比重比重1.077密度梯度离心法分离原理密度梯度离心法分离原理离心前示意图离心前示意图稀释的抗凝血稀释的抗凝血ficoll分离液分离液血浆血浆pbmc（白膜状）（白膜状）1.075ficoll分离液分离液 1.077红细胞、多核白细胞红细胞、多核白细胞 1.092离心后示意图离心后示意图（二）（二）t t、b b 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离1、单核细胞的去除：、单核细胞的去除：（1）黏附去除法）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料

6、或玻璃表面而淋巴细胞不能。原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。（2）l亮氨酸甲酯去除法亮氨酸甲酯去除法（3）羰基铁吞噬离心法）羰基铁吞噬离心法 2、t、b淋巴细胞的分离纯化淋巴细胞的分离纯化（1）尼龙毛柱法）尼龙毛柱法 *原理：原理：b细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏附性的附性的t细胞。细胞。（2）e花环分离法花环分离法 *原理：人成熟原理：人成熟t细胞表面的细胞表面的cd2分子为绵羊红细胞受分子为绵羊红细胞受体（体（e受体），可结合绵羊红细胞形成受体），可结合绵羊红细胞形成e花环，比重花环，比重增大，沉于管底。增大，沉于管底。（3）其它

7、：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法 人成熟人成熟t t细胞表面的细胞表面的cd2cd2分子是绵羊红细胞受体（分子是绵羊红细胞受体（e e受受体），能结合绵羊红细胞形成体），能结合绵羊红细胞形成e e花环，经淋巴细胞分离液花环，经淋巴细胞分离液分离后，因分离后，因e e花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低渗法裂解渗法裂解t t细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的t t细胞。细胞。（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或原理及

8、方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞，细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞，即为巨噬细胞。即为巨噬细胞。免疫细胞的功能检测免疫细胞的功能检测 功能检测的原理及方法功能检测的原理及方法 免疫系统或其他系统的疾病，免疫接免疫系统或其他系统的疾病，免疫接种，某些临床措施或外界环境的影响，均种，某些临床措施或外界环境的影响，均可使免疫细胞的数量和功能发生变化。可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检

9、测，对因此，免疫细胞数量，功能检测，对于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、预防接种的效果评估及环境因素对机体免预防接种的效果评估及环境因素对机体免疫功能影响的判定，都具有重要意义。疫功能影响的判定，都具有重要意义。一、一、免疫细胞的数量检测免疫细胞的数量检测二、免疫细胞的功能检测二、免疫细胞的功能检测淋巴细胞增殖检测淋巴细胞增殖检测淋巴细胞亚群检测淋巴细胞亚群检测免疫细胞自发增殖活性测定免疫细胞自发增殖活性测定免疫细胞增殖检测免疫细胞增殖检测一一. 免疫细胞的数量检测免疫细胞的数量检测检查的项目有：检查的项目有：血中血中t细胞与细胞与b细胞的分类计数细胞

10、的分类计数 血液白细胞的计数血液白细胞的计数 血液中白细胞的分类计数血液中白细胞的分类计数实验方法实验方法e玫瑰花环实验玫瑰花环实验(检测检测t细胞细胞)b细胞膜免疫球蛋白检测细胞膜免疫球蛋白检测e玫瑰花环实验玫瑰花环实验 原理原理:绵羊红细胞绵羊红细胞t细胞细胞形如花环，比重变大，离心形如花环，比重变大，离心沉淀沉淀b细胞膜免疫球蛋白检测细胞膜免疫球蛋白检测 原理：荧光素原理：荧光素抗抗ig特异性抗体特异性抗体b细胞表面膜细胞表面膜免疫球蛋白免疫球蛋白(mig) 返回二二. 免疫细胞的功能检测免疫细胞的功能检测刺激物刺激物非特异性非特异性:有丝分裂原有丝分裂原 pha、cona 微生物及其代

11、谢产物微生物及其代谢产物 葡萄球菌葡萄球菌 蛋白物质蛋白物质 胃蛋白酶胃蛋白酶 抗体抗体 抗抗cd3、cd4抗体抗体 淋巴因子淋巴因子特异性：特异性抗原物质特异性：特异性抗原物质淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。淋巴细胞转化试验的检测方法淋巴细胞转化试验的检测方法(一一)形态学方法形态学方法 淋巴细胞淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞染色镜检染色镜检(二二) 3htdr掺入法掺入法 有丝裂原或抗原有丝裂原或抗原淋巴细胞淋巴细胞染色体复制染色体复制3htdr掺入掺入 淋巴细胞摄取淋巴细胞摄取测定放射量测定放射量(三三) mtt比色法比色法 返回

12、(一一)免疫荧光法免疫荧光法 (二二)免疫酶标法免疫酶标法(三三)荧光激活细胞分类仪检测荧光激活细胞分类仪检测t细胞亚群细胞亚群（t细胞和细胞和b细胞检测方法相同细胞检测方法相同,现以现以t细胞为例进行讲解细胞为例进行讲解.）淋巴细胞亚群检测的方法淋巴细胞亚群检测的方法(一一)免疫荧光法免疫荧光法 直接法直接法:荧光素荧光素单克窿抗体单克窿抗体淋巴细胞淋巴细胞 间接法间接法:荧光素荧光素第二抗体第二抗体(羊或兔的抗鼠羊或兔的抗鼠igg) mcab介导介导淋巴细胞淋巴细胞 (二二)免疫酶标法免疫酶标法abc法法:亲和素酶标生物素亲和素酶标生物素复合物复合物生物素化的二抗生物素化的二抗mcab介介导和酶催化底物作用导和酶催化底物作用t细胞着色细胞着色 apaap复合物复合物兔抗鼠兔抗鼠igg