人α-干扰素与乙型肝炎病毒前S2嵌合蛋白的表达纯化和鉴定

1、人-干扰素与乙型肝炎病毒前S2嵌合蛋白的表达纯化和鉴定【摘要】目的重组表达人-干扰素与乙型肝炎病毒前S2融合蛋白(IFN-Pre S2)，探索治疗HBV感染的特异性免疫药物。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出人IFN-2b和HBV Pre S2基因片段，分步克隆获取融合基因，构建pBV-IFN-Pre S2重组表达载体，转化E.coli后诱导表达IFN-Pre S2融合蛋白。结果在E.coli中表达了相对分子质量为27 000的目标蛋白，后者以包含体形式存在，表达量占菌体总蛋白的15%。经过反相高效液相色谱(RP-HPLC)等步骤纯化后，目标蛋白纯度达到95%。复性的表达产物在体外测定具

2、有相应的生物活性和免疫学特性，干扰素生物比活达到108 IU/mg蛋白质。融合蛋白能与抗IFN-抗体、抗HBVPre S2抗体及多聚人血清白蛋白(PHSA)结合。结论在原核系统中有效表达了具有高生物活性的IFN-Pre S2融合蛋白。【主题词】肝炎病毒，乙型； 干扰素； 病毒融合蛋白质类 Expression, purification and identification of human IFN- 2 b/HBV Pre S2 fusion proteinXU Dongping, HAN Fenglian, SHI Hong, et al.（Department of Biological

3、 Engineering, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China）【Abstract】ObjectiveTo express a fusion protein of human interferon- 2b and HBV Pre S2 in E.coli for the purpose of investigating anti-HBV immunomodulatory protein.MethodsHuman interferon-2b and HBV Pre S2 encoding genes were amplified from pla

4、smid templates through PCR, then fused and cloned into plasmid pBV220 through engineering technique to generate expression plasmid pBV-IFN-Pre S2. The plasmid was transfected into E.coli to produce fusion protein. RP-HPLC and ion-exchange chromatography were employed to purify fusion protein.Results

5、27 kDa fusion protein was expressed up to 15% of total bacterial protein in E.coli. After purification, the purity of fusion protein reached 95% of total protein. Anti-viral assay showed that IFN-Pre S2 protein induced a VSV-resistant activity of 1.25108 IU/mg protein in Wish cell line, similar to t

6、he bioactivity of original recombinant human IFN- 2 b. ELISA data showed that IFN-Pre S2 protein had antigenicities of both human IFN- 2b and HBV Pre S2. In addition, fusion protein showed the feature of binding to polymeric human serum albumin (PHSA).ConclusionThe bifunctional fusion protein was ef

7、ficiently expressed in E.coli. The work provided initial evidence for studying PHSA-receptor-targeting IFN- 2b,which might have potential application for the treatment of HBV infection.【Key words】Hepatitis B virus; Interferon-alpha; Viral fusion proteins乙型肝炎病毒前S2(HBV Pre S2)基因编码蛋白含55个氨基酸残基，具有多聚人血清白蛋

8、白受体(PHSA-R)活性，可在人体血液中PHSA介导下使HBV与人肝细胞表面的PHSA-R结合，是HBV感染嗜肝性的重要机制之一。Pre S2蛋白可诱导机体产生保护性免疫应答，可能在抵抗HBV感染过程中起重要作用1。-干扰素(IFN-)是一种多功能免疫调节因子，可诱导细胞产生抗病毒蛋白，具有独特的抗病毒作用。将上述两种基因融合后表达的融合IFN-Pre S2蛋白，有可能增强Pre S2蛋白诱导免疫应答的能力及产生具有嗜肝性的导向干扰素分子。为了证实这种假设，我们利用基因重组技术构建了人IFN-2b和HBV Pre S2融合基因的表达载体pBV-IFN-Pre S2，并在大肠埃希菌中有效表达了

9、具有相应于IFN-2b和Pre S2的生物学活性和免疫学特性的融合蛋白。1材料和方法1.1质粒和细胞株含有头尾相连HBV ayw全长DNA双体的pCP10质粒为302医院病毒研究室提供。含有人IFN-2b编码基因的pB-IFN质粒为302医院生物工程室构建，pGEM3Zf(-)质粒购自华美公司，pBV220质粒和DH-5菌株由军事医学科学院逯好英教授提供，Wish细胞株和VSV病毒由中国医学科学院吴易元教授惠赠。1.2主要试剂和材料工具酶购自美国Promega公司和华美公司。PCR产物纯化剂盒为美国Clontech公司产品。干扰素ELISA检测试剂为邦定医学生物公司产品。抗-HBV Pre S

10、2 McAb购自北京人民医院试剂中心。PHSA制备参照文献2方法进行。反相高效苯基柱ISB-10(20 mm300 mm)为天津新元生物技术有限公司产品。DEAE Sepharose Fast Flow层析填料为美国Pharmacia公司产品。转膜用硝基纤维素滤膜为美国Schleicher、Schuell公司产品。PCR引物由上海生物工程公司合成，DNA序列分析在我室ABI310基因分析仪上进行。1.3重组质粒的构建利用两对设计引物分别从质粒模板中扩增出498 bp IFN-2b编码基因片段(P1+P2扩增pB-IFN)和165 bp HBV Pre S2基因片段(P3+P4扩增pCP10)，

11、引物设计下：P1，5-GGAATTCATGTGTGACCTGCCGCA-3；P2，5-GGGGATCCTGGGCTTTCTTTAGAACGCAGA-3；P3，5-CGGGATCCATGCAGTGGAATTCCA-3；P4，5-GCGTCGACTTAGTTCAGCGCAGGGTC-3。采用分步克隆法，即先将IFN-2b编码基因克隆入pGEM3Zf(-)载体，再利用基因间连接序列上设计的BamH 位点，将HBV Pre S2基因连接到IFN-2b基因3末端，转化JM109菌，获得含有融合基因的pGEM-IFN-Pre S2克隆。连接序列为AGCCCAGGATCC，编码丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丝氨酸

12、。提取重组质粒，用EcoR和Sal双酶切获取690bp的融合基因片段，与用相同酶切处理的pBV220载体连接，转化DH-5宿主菌，获得pBV-IFN-Pre S2-表达克隆。对重组质粒进行酶切和DNA序列分析鉴定。1.4融合蛋白的表达挑取pBV-IFN-Pre S2表达克隆单菌落，接种LB培养基进行一级扩增，产物以150接种M9CA培养基，30振荡培养67 h后，升温至42诱导表达4 h，离心收集菌体。1.5表达产物的纯化上述收集的菌体经超声破碎后离心收取包含体，充分洗涤后，用7 mol/L盐酸胍裂解包含体。样品经稀释复性后用ISB-10反相高效苯基柱反复纯化2次，流动相为乙腈，第一次为阶段洗

13、脱，第2次为梯度洗脱，两次洗脱间用DEAE Sepharose Fast Flow离心交换层析柱脱乙腈，目标蛋白峰集中在20%22%乙腈洗脱峰内。1.6表达产物反应原性和PHSA-R活性的检测采用ELISA法，参照干扰素ELISA检测试剂盒说明方法进行操作，但针对不同检测目的采用了不同包被物，即以抗-IFN-抗体包被检测IFN-反应原性，抗-IFN Pre S2抗体包被检测HBV Pre S2反应原性。检测PHSA-R活性用10 g/ml PHSA包被，并用10 g/ml HSA(人血清白蛋白)包被作为对照。标记物均为抗-IFN- McAb-HRP，样品经10倍或3倍倍比稀释后进行检测，以P/

14、N2.1的最高稀释度评估样品的反应原性或受体活性，样品在该稀释度的蛋白质摩尔浓度即为样品检出浓度。1.7表达产物抗病毒生物活性检测采用Wish细胞-VSV病毒检测系统，方法参照文献3。1.8Western blot杂交参照文献4方法进行电泳和转膜，所用滤膜为0.45 m孔径的硝基纤维素滤膜，检测抗体为抗-IFN- McAb-HRP。2结果2.1重组质粒的构建见1。 1融合干扰素基因重组质粒Fig.1Map of pBV-IFN-PreS2 expression plasmid2.2融合基因的构建经酶切和DNA序列分析证实构建的融合基因与预期完全相符。融合基因的DNA序列测定结果和对应的编码氨基

15、酸序列见2。 2融合干扰素的基因序列及对应的氨基酸序列Fig.2Sequences of fusion human IFN- 2b/HBV PreS2 gene and its encoding IFN-PreS2 protein:Linking sequence between two genes2.3融合蛋白的表达SDS-PAGE电泳和密度扫描分析表明，融合蛋白以包含体形式表达，相对分子质量为27 000左右，与预期的大小一致，表达量占菌体总蛋白质的15%，经RP-HPLC等步骤纯化后纯度可达到95%。融合蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳结果见3。1：相对分子质量参照物；2：纯化的嵌合蛋

16、白；3：包含体裂解物；4：诱导菌裂解物；5：未诱导菌裂解物3嵌合干扰素SDS-PAGE鉴定结果Fig.3SDS-PAGE analysis for IFN-PreS2 chimeric protein1:Molecular-weight markers. 2: Purified chimeric protein. 3:Lysate of inclusion body. 4: Lysate of induced bacteria. 5:Lysate of uninduced bacteria2.4反应原性及PHSA-R活性受检样品经复性纯化，蛋白浓度为0.24 mg/ml。结果显示样品经106倍

17、稀释仍可检出IFN-反应原性，检出浓度为8.910-12 mol/L，与rhIFN-2b反应原性相当，后者为6.610-12 mol/L。检出Pre S2反应原性的稀释度为3-5倍，检出浓度为3.610-8 mol/L。PHSA结合活性可在3-7倍稀释度检出，检出浓度为4.110-9 mol/L，而作为对照的HSA结合活性高于3-2倍稀释度就不能被检出。PHSA结合活性检测结果见4。4ELISA测定融合蛋白PHSA结合活性Fig.4PHSA binding activity of fusion protein determined by ELISA2.5抗病毒生物活性用Wish-VSV系统检测

18、干扰素活性，融合蛋白为1.25108 IU/mg蛋白，rhIFN-2b对照为2.5108 IU/mg蛋白。2.6Western blot融合蛋白经SDS-PAGE电泳后再行电转膜，用抗-IFN-McAb-HRP在27 000处可清晰地检出抗原抗体特异结合带。3讨论我们重组构建了与设计完全一致的人IFN- 2b和HBV Pre S2融合基因克隆，并在大肠埃希菌中有效表达了IFN-Pre S2融合蛋白，表达量占菌体蛋白质的15%。融合蛋白由225个氨基酸组成，相对分子质量为27 000，经过RP-HPLC等步骤纯化，纯度可达到95%。融合蛋白具有较高的干扰素生物比活性，能够有效结合PHSA，并可与

19、抗-IFN-和抗-Pre S2抗体结合。HBV Pre S2基因编码产物含有人类T细胞和B细胞识别表位，可诱导机体产生保护性免疫反应5。将具有免疫活性的细胞因子如IL-2与PreS2融合表达可显著增强Pre S2的抗原递呈能力6。近来研究还表明，Pre S2基因编码产物对维持HBV颗粒完整性及感染性至关重要7。Pre S2蛋白的另一个重要特性是具有PHSA-R活性，在PHSA介导下可与肝细胞膜上的同类受体结合。将人IFN-和HBV Pre S2基因融合表达产生的融合蛋白，有可能显著增强Pre S2分子诱导机体产生有效的保护性免疫应答，以及通过PHSA-R活性介导干扰素分子结合至肝细胞。为此，具

20、有双重生物学活性的IFN-Pre S2融合蛋白的成功表达为进一步开展预防和治疗HBV感染的相关研究提供了必要的实验基础。作者单位：徐东平（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）韩凤连（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）施红（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）王福生（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）程云（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）金磊（100039北京，解放军302医院生物工程研究室）参考文献1，成军.乙肝病毒基因的结构与功能.见：成军，杨守纯，主编.现代肝炎病毒分子生物学.北京：人民军医出版社，1997.25-43.2，Ohnuma H, Takahashi K, Kishimoto S, et al. Large hepatitis B surface antigen polypeptides of Dane particles with the recep