油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

1、油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化                          参考文献:1骆建新,郑崛村,马用信,等.人类基因组计划与后基因组时代J.中国生物工程杂志, 2003, 23(11): 87-93.2李林.蛋白质组学的进展J.生物化学与生物物理进展, 2000, 27(3): 227-231.2003年4月14日, Co

2、llins对于人类基因组序列图谱绘制成功的宣布,标志着“人类基因组计划”胜利完成和“后基因组时代”(postgenome era)正式来临1。后基因组时代中,生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学(Proteomics)2。自澳大利亚学者W ilkins和W illiams等人31994年第一次提出蛋白质组的概念以来,蛋白质组学得到了空前的发展,目前已成为功能基因组学的主要研究内容之一。双向电泳(Two-DimensionalElectropho-resis, 2-DE)技术与质谱技术、生物信息学并列为蛋白质组学三大核心技术4。其中,双向电泳是由OFarrell于1975年建立的5。作

3、为经典的蛋白质分离技术,双向电泳技术已被广泛应用于生物、医学和农业等领域研究。在农业领域具体涉及到作物受病原菌侵染后的蛋白质组变化6,作物对逆境因子如干旱7、盐8, 9、冷1012、铝13等胁迫反应的蛋白质组变化14,植物雄配子体发育过程中蛋白质组的变化15, 16,植物雄性不育差异蛋白质组分析1719等方面。近年来,关于小麦20, 21、水稻22等作物的蛋白质组学的报道日益增多,但油菜方面较为少见23, 24,本研究探索了油菜叶片、花蕾、花药高质量总蛋白的提取方法,并对后续的双向电泳体系进行了优化,以期对今后的油菜蛋白质组学研究提供技术支持。1材料与方法1.1实验材料供试材料为显性核不育油菜

4、Shaan-GMS25,大田播种,正常管理。在油菜现蕾开花时,分别取不育株和可育株的花序和叶片, 0冰壶带回。大于3mm的花蕾在4下挑取花药,装于冻存管中作为花药样品,与小花蕾及叶片分别经液氮速冻后于-80冰箱保存,用于蛋白质组学的进一步研究。1.2主要试剂和仪器试剂:蛋白提取药品,包括尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、CHAPS(3-3-(胆酰氨丙基)二甲氨基丙磺酸内盐)、二硫苏糖醇(DTT)等为国产分析纯(由国药集团化学试剂有限公司提供)外,其余同试剂中描述。试剂: IPG(固定pH梯度)干胶条( Immobi-lizedDrystrip; pH 310, 18cm; pH 47

5、, 18cm)、IPG缓冲液(pH 47)、矿物油、尿素(Urea)、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉-双丙烯酰胺(N,N -' Methylene Bisacrylamide)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、碘乙酰胺(Iodoacetmide)、三羟甲基氨基甲烷( Tris base)、十二烷基磺酸钠( SDS)和2-D QuantKit等均为GHealthcare公司产品;硫脲、碳酸钠、醋酸钠、溴酚蓝为BBI公司产品;甘氨酸为日本分装;低熔点琼脂糖为Amresco公司产品;五水硫代硫酸钠、硝酸银等为Sigma公司产品,其他药品

6、为国产分析纯,由国药集团化学试剂有限公司提供。所有试剂均用去离子水配制。仪器: IPGphor等电聚焦电泳仪(Ettan IPGphIII)及附件(Manifold胶条槽等)、EttanDALT six垂直电泳系统、Image Scaner III扫描仪、蛋白质电泳分析软件(ImageMaster2D Platinum 6. 0)均为美国GHealthcare公司, SPECORD分光光度计为德国Anlytik JenaAG公司产品, 1-16K高速冷冻离心机为美国Sigma公司产品。1.3不同器官高质量总蛋白的提取方法参照Gallardo等26方法并略有改进。取花药(约400mg),加入10

7、% PVP和少量石英砂,于液氮中充分研磨成粉末,悬浮于含10%三氯醋酸(TCA和0. 07% DTT的预冷丙酮溶液(35倍体积)中-20过夜; 4、40 000g离心1h(或30min),弃上清;重悬沉淀于含0. 07% DTT的预冷丙酮溶液中1h; 4、40 000 g离心1h(或30min),取沉淀;重复洗涤沉淀35遍;真空冷冻干燥沉淀。每1mg蛋白粉加2030L蛋白质裂解缓冲液(7mol/L尿素2mol/L硫脲, 4% CHAPS, 65mmolDTT, 0. 5% pH10或pH 47的IPG缓冲液,全蛋白酶抑制片剂(Complete Protease Inhibitor Coctai

8、l Tablets, 10mL片), 4搅拌至沉淀溶解;冰浴超声波处理1 min使蛋白充分溶于裂解液中; 4、40 000 g离心15m或更长,取上清液,即蛋白质样品溶液。叶片及小花蕾样品参照花药总蛋白提取方法。1.4蛋白定量使用GE定量试剂盒2-D QuantKit定量。用1. 5mL离心管分装, -80储存备用。1.5双向凝胶电泳主要技术环节均做2次胶重复。1. 5. 1第一向等电聚焦(IEF)采用Ettan IPGphIII等电聚焦仪,第一向等电聚焦电泳主要依据GHealthcare公司双向电泳操作手册进行,并参照G rg的方法27略有改动。将定量的蛋白样品分别按150g/Strip和1

9、80g/Strip加入适量的样品水化液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、2% CHAPS、1%DTT、0. 5% pH 310或pH 47的IPG缓冲液、0. 001%溴酚蓝)充分混匀至总体积为350L。等电聚焦设置两个程序(表1)。1. 5. 2IPG胶条平衡取出带样品的胶条先后于5mL胶条平衡缓冲液I (6mol/L尿素, 2% SDS,50mmol pH 8. 8 Tris-HC,l 30%甘油, 2% DTT,0. 001%溴酚蓝)和5mL胶条平衡缓冲液(6mol/L尿素, 2% SDS, 50mmol pH 8. 8Tris-HC,l 30%甘油, 2. 5%碘乙酰胺, 0. 0

10、01%溴酚蓝)中各平衡15min,用去离子水冲洗干净。1. 5. 3第二向SDS-PAGE凝胶电泳采用EttanDALT six垂直电泳系统,胶浓度分别采用10%和12%,电泳方式为恒功率, 10冷水循环, 0. 5W /Strip进胶45min, 10W /Strip 55. 5h,直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0. 5cm时停止电泳。1. 5. 4银染按GEHealthcare公司双向电泳操作手册进行,并略有改动。其基本流程为:固定液( 40%乙醇, 10%乙酸)中固定12h或过夜;敏化液( 30%乙醇, 0. 32% 5H2O·硫代硫酸纳, 7. 1%乙酸钠)中敏化30min;去

11、离子水洗3次,每次5min;银染液(0. 25%硝酸银)中染色20min,去离子水洗2次,每次1min,显色液(2. 5%碳酸钠, 0. 04%甲醛)中显色25min,至蛋白质点完全显现为止;倒去显影液,立即换终止液(5%冰乙酸)停止显色反应;10min后用去离子水洗涤3次,每次5min;保存液(30%乙醇, 4. 6%丙三醇)中保存。1.5. 5图像扫描与分析染色完成的双向电泳凝胶经Image Scanner扫描仪以及Lab Scan扫描软件扫描凝胶获取图像,透射扫描,光学分辨率为300dpi。用ImageMaster2D Platinum 6. 0分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配

12、和获取斑点位置坐标等分析。2结果与分析2.1不同提取试剂差异分析分别采用蛋白提取试剂和试剂提取油菜叶片总蛋白。用试剂提取的总蛋白在蛋白图谱中出现了蛋白修饰现象(如图1-A的a、b、c、d、e、f、g):在双向电泳胶上原本只应该有一个蛋白点的地方由于蛋白质发生了修饰,分子量没有大的变化而等电点发生改变,从而出现了在分子量相同的地方横向延伸出多个蛋白点的现象。不同的是,采用试剂提取的总蛋白得到的蛋白图谱很好地保留了原始蛋白点情况,与图1-A中对应的蛋白点用相同字母标出(图1-B)。以b处的蛋白点为例,图1-B中b处有一个蛋白点,而图1-A中与之相对应的点却横向延伸出了6个,延伸出来的点均为蛋白质假

13、点,其他6处的情况与此类似。2. 2不同电泳体系对2-DE图谱的影响采用试剂中的蛋白提取试剂提取油菜花药总蛋白,分别用不同的电泳体系进行第一向等电聚焦和第二向凝胶电泳。图2-A显示,采用IEF程序并没有将蛋白完全分离开,尤其中性偏酸区域的蛋白点很多还聚集在一起;而采用IEF程序II则在pH梯度方向获得了较好的蛋白点分离效果(图2-B、C和D),这表明等电聚焦的时间一定要足够,否则会影响等电聚焦效果。采用12%的胶浓度得到的图谱(图2-B)蛋白点纵向分布比较集中,重叠现象严重,且发现高分子量蛋白居多,并主要分布于中性偏酸的区域;采用10%的胶浓度得到的图谱(图2-C和D)虽然损失了一些低分子量的

14、蛋白,但是蛋白点却被较好地分开,较少有明显的蛋白重叠现象,这表明10%的凝胶浓度更适合于蛋白点的分离。采用pH310的IPG Strips得到了全pH范围的蛋白点(图2-A、B和C),较多的蛋白点集中在中性偏酸的区域,而碱性端蛋白数量较少,且蛋白点存在一些重叠现象;采用pH47的IPG Strips得到的蛋白图谱中虽然损失了碱性端的部分蛋白点,却保留了中性偏酸区域的大部分蛋白点,且蛋白点被更好地分离,没有明显的重叠现象,在整个图谱上的分布较为理想(图2-D)。中性偏酸区域的大部分蛋白点,且蛋白点被更好地分离,没有明显的重叠现象,在整个图谱上的分布较为理想(图2-D)。因此,对于油菜不同器官总蛋

15、白样品,采用IEF程序II、pH47的IPG Strips和10%的第二向SDS-PAGE凝胶浓度能获得比较理想的电泳结果。2.3上样量差异分析采用试剂II提取油菜花药总蛋白,选用18cm、pH 47 IPG胶条,分别取120、150和180g的花药蛋白样品进行双向电泳。上样量为120g时, 2D图谱上蛋白点较少,只检测到623个蛋白点,蛋白点丰度均较弱,且低丰度蛋白不能被检测到,影响了双向电泳的准确性和重复性(图3-A);上样量为180g时,蛋白点数较多,检测到1 241个蛋白点,但高丰度蛋白点面积过大,且许多蛋白点相互重叠,影响蛋白点的检测和分析(图3-C);蛋白上样量为150g时,蛋白点

16、清晰,重叠现象少,图谱质量最佳(图3-B)。2.4蛋白分离的重复性及其效果经ImageMaster 2D Platinum 6. 0软件分析,获得用散点图(ScatterPlot)表征同一材料(花药)的两块凝胶蛋白点体积值(Vol)之间的线性关系(图4)。X和Y分别表示同一个材料的两块不同凝胶上的蛋白质点,两块胶上匹配的蛋白点中有430个线性相关系数高于0. 851,说明这430个蛋白点相似度很高的,在两块胶中质和量上没有差异,表明本研究得到的结果具有很好的重复性。2.5油菜不同器官蛋白分析采用试剂提取油菜花药和叶片总蛋白,选用图4蛋白点群的散点图Fig. 4D iagram of prote

17、in scatter spots10%浓度胶进行双向电泳。经Image Master 2DPlatinum 6. 0软件统计分析,在相同的参数设置条件下,油菜花蕾2D图谱中能检测到890个蛋白点;花药933个蛋白点;叶片751个蛋白点(图5)。由三个器官提取的总蛋白2D图谱中蛋白点都非常清晰,多数呈规则的圆形,无横纵条纹干扰问题,背景干净,且点的重复性很好。3结论与讨论随着技术的进步,双向电泳技术已从最初的载体两性电解质管胶发展到20世纪80年代的固相pH梯度凝胶电泳,这大大提高了双向电泳的分辨率和重复性28。但对于不同的材料,蛋白质的制备、电泳条件等一些细节问题还需要不同的优化处理,本研究经

18、过优化蛋白提取及电泳条件等得到了较好的适合油菜蛋白质组学研究的方法。3.1蛋白样品的制备样本制备是双向电泳的第一个环节,对于获得高清晰度的蛋白双向电泳结果至关重要。而不同的样品其提取高质量蛋白的难易又有差别,本研究采用TCA-丙酮法,对油菜叶片、花蕾、花药等不同器官的蛋白质提取过程以及双向电泳条件进行了优化,得到了背景干净,蛋白点清晰,基本无纵横条纹的双向电泳图谱。植物材料不同于动物和微生物,植物组织中色素、酚类、醌类等次生代谢物质会影响植物蛋白的提取质量并最终影响到双向电泳的效果29。与前人23, 24对于芸薹属植物总蛋白提取相比,本研究在液氮中加入10% PVP,能有效吸附花蕾及花药组织中

19、的色素和酚类物质,对于减少蛋白质的修饰也起到了很好的作用;同时加入了少量的石英砂,对破坏植物组织、在液氮中充分研磨都起到了很好的效果。另外采用0. 07%DTT的预冷丙酮-20沉淀3次和40 000g高速离心,有利于去除干扰物质。蛋白提取过程中,蛋白质裂解液中加入了CompletProtease InhibitorCoctailTablets,能很好地抑制蛋白酶的作用,减少了蛋白的降解。本研究裂解蛋白时还采用了冰浴超声波处理,使蛋白更好地溶解到裂解液中,也有效去除了核酸的影响。通过两类试剂的对比可以看出,试剂的纯度对于获得高质量的蛋白非常关键,尤其是尿素等试剂的纯度,并且要特别注意蛋白裂解需在

20、36以下进行,以避免造成本文描述的蛋白质假点现象(图1-A);蛋白质假点可能是一种由于试剂(如尿素)纯度不够等原因造成的蛋白质修饰(氨基甲酰化)。蛋白提取过程中对于温度的控制也很关键,从植物组织的采取、存放到上样都必须严格低温操作才能有效降低蛋白质的降清晰,几乎无纵横条纹现象,表明优化后的提取方案适合于油菜的蛋白质组学研究。3.2电泳条件提取的蛋白样品中影响双向电泳结果的关键的因素之一是盐离子的浓度。当样品中盐离子浓度超过一定数值时,会使等电聚焦过程中电流增大而造成压升缓慢、聚焦时间延长,最终严重影响等电聚焦的效果。本研究采用TCA-丙酮法提取油菜不同器官的总蛋白,很好的降低了盐离子的浓度,同

21、时采用延长等电聚焦过程中低电压除盐时间,使得电压顺利达到了预设的聚焦高电压值,最终获得了理想的聚焦效果。另外本研究对于聚焦时间做了一个对比,对于18cmIPG胶条/150g的上样量, 10 000V电泳6h不能充分聚焦,尤其酸性端蛋白的聚焦效果很差,许多蛋白聚集连结在一起,未能充分分离开,选择10 000V电泳8h时,蛋白充分聚焦。合适的上样量对于得到高分辨率且涵盖尽量多蛋白点的电泳图谱是至关重要的。当上样量较低时,许多低丰度蛋白将不会被显现出来,蛋白点的数目会较少;当上样量较高时,会出现蛋白重叠现象,严重影响电泳图谱的分辨率。本研究对于适合油菜不同器官蛋白的上样量进行了探索,发现150g为最

22、佳,得到的2D图谱中蛋白点清晰,且无明显重叠现象。选择合适的胶条种类对于得到高分辨率且适合于某一特定材料的电泳图谱是非常重要的。G rg等报道,采用窄范围pH梯度胶条对蛋白质进行分离,可以提高蛋白的分辨率,增加该pH值范围内所检测到的蛋白数30。本研究首先采用pH310线性IPG胶条对油菜花药蛋白质进行分离,发现大部分蛋白集中在中性偏酸区域,且在此范围内蛋白点有重叠现象,改用pH47的线性IPG胶条后,基本消除了蛋白点重叠现象,大大地提高了该pH范围内的分辨率。第二向SDS-PAGE胶浓度的选择也很重要。本研究在舍弃少部分小分子量蛋白的情况下,采用10%的凝胶得到了高分辨率的电泳图谱。另外采用

23、恒功率方法,先用低功率(0. 5W /Strip)进胶, 45min后改成高功率(10W /Strip)分离进胶后的蛋白, 55. 5h后结束电泳,电泳过程中采用10冷水循环,避免高温对蛋白和凝胶质量的影响,效果很好。3.3油菜花药、花蕾及叶片总蛋白的分离本研究对油菜花药、花蕾及叶片总蛋白提取方法进行了摸索,发现叶片的提取相对简单,而花药和花蕾总蛋白的提取相对较复杂,这与不同植物组织含有的次生代谢物的种类和量有关。叶片组织中含有的次生代谢物的种类和量相对较少,而花药和花蕾组织中含有的酚类、色素等杂质较多,会严重影响高质量总蛋白的提取。通过在研磨样品时加入10%PVP以及用0. 07% DTT的

24、预冷丙酮充分洗涤蛋白35次,则可以有效去除这些杂质,得到高质量的蛋白提取物。比较油菜三个组织的电泳图谱,发现花药中检测到的蛋白点数多于花蕾和叶片,以叶片最少,这可能与不同器官的高丰度蛋白的含量有关。在叶片中含有大量叶绿体及很多与光合作用有关的Rubisco羧化酶/加氧酶等高丰度蛋白;花蕾样品中有萼片,也具有一定含量的该种酶;而花药中几乎没有叶绿体,所以很少有这种酶。在相同上样量的情况下,高丰度蛋白占的比重越大检测到的低丰度蛋白越少。本研究油菜三个不同器官的电泳图谱结果验证了这一点。蛋白质组学研究中对于重复性要求很高,本研究从蛋白制备到获得电泳图谱,主要技术环节进行了2次重复,最终得到的电泳图谱重复性较好且分辨率较高。综上,以TC