生物化学实验：SDS-PAGE测定蛋白质分子质量

1、电泳技术理论电泳技术理论n一、电泳定义：带电荷的颗粒在电场的作用下向其电一、电泳定义：带电荷的颗粒在电场的作用下向其电性相反的的方向移动。性相反的的方向移动。n二、电泳分类：二、电泳分类：n按电荷量分离按电荷量分离n按分子量分离按分子量分离n按等电点分离按等电点分离n三、三、SDS-PAGESDS-PAGE应用：应用：n1 1、测分子量、测分子量n2 2、分离鉴定、分离鉴定n3 3、双向电泳第二向、双向电泳第二向SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子质量测定蛋白质分子质量n一、原理：一、原理：n SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都

2、能是根据大多数蛋白都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物按重量比结合成复合物,使蛋使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出样品的分子量。标准曲线中求出样品的分子量。n相对迁移率和分子量计算相对迁移

3、率和分子量计算 LogM=a-bRf n相对迁移率相对迁移率(Rf)蛋白移动的距离蛋白移动的距离/染料移动的前沿距离染料移动的前沿距离n 以以Rf为横坐标为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上在半对数坐标纸上绘图绘图,由标准曲线中查出样品分子量。由标准曲线中查出样品分子量。 SDS-PAGE实验流程（SDS-PAGE)n电泳技术流程：电泳技术流程：n制备载体（制胶）制备载体（制胶）加样加样电泳电泳剥胶剥胶染色染色脱色脱色测定结果测定结果( (凝胶成像凝胶成像）n常用载体制备：常用载体制备：n丙烯酰胺丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（催

4、化剂）（催化剂） 聚丙聚丙烯酰胺凝胶烯酰胺凝胶nSDS的作用：球形蛋白+ SDS 长棒形蛋白长棒形蛋白（线状）（线状）n样品处理液（巯基乙醇）样品处理液（巯基乙醇）-S-S- -HS,SH-S-S- -HS,SH-n聚丙烯酰胺凝胶作用：分子筛聚丙烯酰胺凝胶作用：分子筛实验设计思路nSDS-PAGESDS-PAGE实验设计：实验设计：n1 1、浓缩胶（堆积胶）浓缩效应、浓缩胶（堆积胶）浓缩效应5%5%n由三个不连续组成：由三个不连续组成：n凝胶浓度不连续凝胶浓度不连续n凝胶缓冲液凝胶缓冲液pHpH不连续（不连续（pH6.8;pH8.8)pH6.8;pH8.8)n凝胶缓冲液负离子不连续：氯离子，甘

5、氨酸凝胶缓冲液负离子不连续：氯离子，甘氨酸根负离子根负离子n2 2、分离胶（、分离胶（14%14%）二、实验方法二、实验方法n实验方法：实验方法：n样品处理：样品处理：100uL100uL样品样品+100uL+100uL处理液混匀处理液混匀( (沸水浴加热沸水浴加热5 5分分钟钟) )n1 1、灌制分离胶、灌制分离胶 ：n 加入试剂如下：两块加入试剂如下：两块1414 的分离胶，需的分离胶，需12mL12mL液体液体n A A液液 5.6mL5.6mLn B B液液 3.0mL3.0mLn 蒸馏水蒸馏水 3.4mL3.4mL（超纯水超纯水）n 1010 过硫酸铵过硫酸铵 0.1ml0.1ml（

6、最后加）（最后加）n TEMED 0.01mLTEMED 0.01mLn 混合后，用小滴管加入制胶室中，加入高度距短玻板混合后，用小滴管加入制胶室中，加入高度距短玻板1.5cm1.5cm左右，缓慢加入蒸馏水压平，聚合约左右，缓慢加入蒸馏水压平，聚合约3030分钟。分钟。二、实验方法二、实验方法n2 2、灌制堆积胶：、灌制堆积胶： 5% 4mL5% 4mLn 待分离胶聚合后，用滤纸吸去上层水，注意不要碰到待分离胶聚合后，用滤纸吸去上层水，注意不要碰到胶面，然后配制堆积胶，加入试剂如下：胶面，然后配制堆积胶，加入试剂如下：n A A液液 0.67 mL0.67 mLn C C液液 1.0 mL1.

7、0 mLn 蒸馏水蒸馏水 2.3 mL 2.3 mL （超纯水超纯水）n 1010过硫酸铵过硫酸铵 0.03mL 0.03mL （最后加）（最后加）n TEMED 0.005mLTEMED 0.005mLn 混合后加入制胶室中，加上梳子，待聚合后拔出梳子，混合后加入制胶室中，加上梳子，待聚合后拔出梳子，将玻板装在电泳槽架上，用小滴管加好电泳缓冲液，赶走将玻板装在电泳槽架上，用小滴管加好电泳缓冲液，赶走气泡。气泡。n3 3、加样、加样1515微升左右（微量进样器）（微升左右（微量进样器）（样品及标准蛋白预样品及标准蛋白预先用处理液混合沸水浴加热先用处理液混合沸水浴加热5 5分钟分钟）。）。n3 3、电泳条件：电压、电泳条件：电压150-180150-180伏伏n4 4、剥胶染色：、剥胶染色：1515分钟分钟n5