长春中医大《中药化学》课件03分离精制方法

1、分离精制方法各种分离方法一般选择顺序溶剂法（系统溶剂提取法）溶剂分配法（系统溶剂法）其他方法（沉淀法）/膜分离法各种色谱法重结晶法溶剂法（系统溶剂提取法）固体药材极性递增的溶剂依次进行提取石油醚提取，滤过油脂、蜡、挥发油、游离甾体及萜药渣（1）挥尽石油醚，用氯仿或乙酸乙酯提取游离生物碱、有机酸 黄酮、香豆素药渣（2）甲醇、乙醇、丙酮（药渣挥散溶剂）药渣（3）糖、苷、生物碱盐、有机酸盐溶剂分配法 液-液萃取法（系统溶剂法）利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离两相溶剂：互相饱和水相和有机相分离极性小的成分 氯仿（或乙醚）-水；石油醚-水分离极性中等的成分 乙酸乙酯水分离

2、极性大的成分 正丁醇水分配系数相差越大，则分离效果越好100，仅作一次简单萃取就可基本达到分离 100 10则需萃取1012次 2则须萃取100次以上分配系数K溶质在上相溶剂中浓度与在下相溶剂中浓度比分离因子A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数比值分离因子与萃取次数的关系常用方法：简单萃取法（ 50）-用分液漏斗 液-液萃取与纸色谱（pH梯度萃取法） 连续萃取法 液滴逆流分配法（50）（CCD）液滴逆流色谱（DCCC）及高速逆流色谱（HSCCC） 用于比水轻的溶剂 用于比水重的溶剂液滴逆流色谱-连续萃取器萃取操作（以系统溶剂萃取法为例）水溶液将石油醚置分液漏斗中，加入水溶液振摇静置待分层，分

3、液上层（石油醚液）下层（水液）如何判断是否分配平衡加入三氯甲烷，振摇，静置待分层，分液上层（水液）下层（三氯甲烷液）加入水饱和正丁醇，振摇，静置待分层，分液上层（正丁醇液）下层（水液）（减压）回收有机溶剂振摇力度判断？两相加入顺序一般为比重小先加入，比重大的后加入如何处理萃取中出现问题萃取乳化现象是萃取中经常出现的问题，即分层不明显出现乳化的原因是因为中药提取液中即含亲水性成分，又含亲脂性成分，振摇后出现水包油或油包水的情况，即产生乳化现象解决办法1.充分静置 ； 2. 加热； 3.放冷； 4.加入表面活性剂5.加入无机盐； 6.分出乳化层，超声处理（酸碱）溶剂法利用混合物中酸碱性不同，通过加

4、入酸或碱以调节溶液pH值，改变混合物中某些成分的溶解性，从而达到分离目的难溶于水有机碱性成分-具有羧基或酚羟基的酸性成分具有内酯或内酰胺的成分通过加入无机酸使其成盐，从而与非碱性成分分离通过加入碱使其成盐，从而与非酸性成分分离通过加入碱皂化溶于水，从而与其他难溶于水的成分分离请写出具体操作方法分配比与pH（酸碱性与萃取法相结合） pH梯度萃取法-对酸性、碱性及两性化合物而言，分配比受溶液的pH值的影响pH值的变化可以改变它们的存在状态（游离型或离解型），从而影响在溶剂系统中的分配比若酸性物质完全解离，即使HA均转化为A-则pH=pKa+2若酸性物质完全游离，即使A-均转化为HA则pH=pKa-

5、2某物质的pKa为10.1，欲使其完全解离，则pH应调节至多少？pH梯度萃取法以pH值成梯度的酸水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱性成梯度的混合碱性溶液（比如，生物碱的混合溶液）再将酸液碱化，得到游离的碱性成分以pH值成梯度的碱水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的酸性成梯度的混合酸性溶液（如酚，酸性成分）再将碱液酸化，则得到游离的酸性成分分离实例：大黄中游离蒽醌的分离pH梯度萃取分离物质的模式图水溶液（酸性/碱性/中性/两性）pH3，有机溶剂萃取水相有机相pH12，有机溶剂萃取水相有机相（中性/两性物质）（碱性）pH9缓冲液提取水相有机相pH3，有机溶剂萃取（酸性物质）水相有机相（酸性物质

6、）pH13缓冲液提取水相有机相（中性）（酸性物质）比较酸性物质与酸性物质的酸性大小？沉淀法水提醇沉醇提水沉分级沉淀氯仿-乙醚盐析法沉淀法请简述沉淀法的概念（或分离原理）基于某些化学成分能与某些试剂生成沉淀或加入某些溶剂后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的方法专属试剂沉淀法 胆甾醇能沉淀甾体皂苷； 生物碱沉淀试剂能沉淀生物碱等 在含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽等。 在混合物的水溶液中，加入易溶于水的无机盐（氯化钠）至一定浓度或状态，使某些中药成分在水中溶解度降低而析出。沉淀法实例原理-根据物质溶解度差别进行分

7、离*1619A.水提醇沉法 B.醇提水沉法 C.醇提醚沉法 D.铅盐沉淀法 E.酸提碱沉法16.从植物药材浓缩醇提液中除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质的方法为17.从植物药材乙醇提取液中使苷类沉淀析出而脂溶性杂质可存留在母液中的 方法为18.用酸性水从药材中提取出生物碱后再使其从水中析出的方法为19.从植物药材浓缩水提取液中除去多糖、蛋白质等水溶性杂质的方法为练习题15色谱分离法 Chromatography1906年俄国植物学家米哈伊尔茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行色带由于这一实验将混合

8、的植物色素分离为不同的色带，称为色谱法 色谱100年回顾瑞典Uppsala大学对生化分离方法贡献16不同色谱材料不同操作方式将各种色谱组合应用分离精制鉴定色谱分离法 Chromatography思考问题：1.常用的分离材料有哪些？ 2.每种分离材料的结构与性质？ 3.分离原理？17 不同操作方式薄层色谱（Thin Layer Chromatography）柱色谱（column Chromatography)纸色谱 (Paper Chromatography)掌握各种色谱方式的缩写色谱分离法 Chromatography 常用分离材料性质及分离原理总结对比（硅胶、大孔吸附树脂、反相硅胶、聚酰胺、

9、 葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂）18 不同分离原理吸附色谱、排阻色谱分配色谱、离子交换色谱吸附色谱利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离排阻色谱（分子筛色谱）根据混合物中各成分分子大小进行分离分配色谱利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同进行分离离子交换色谱利用混合物中各成分解离度的差异进行分离19硅胶/氧化铝/聚酰胺/活性炭不同色谱 材料葡聚糖凝胶离子交换树脂大孔吸附树脂吸附色谱排阻色谱分子筛离子交换分子筛/吸附色谱20吸附色谱常用吸附剂硅胶（应用广泛）氧化铝（碱性氧化铝）聚酰胺（酚类/醌类/黄酮类)活性炭（水溶性、氨基酸、糖类、苷类）化合物结构R-C

10、OOHAr-OHR-OHR-NH2, R-NH-RR-CHOR-CO-RR-COO-RR-O-RR-XR-H利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离化合物极性与Rf值一般规律： 化合物极性越大，Rf值越小展开剂（洗脱剂）：常用亲脂性或中等极性展开剂检视：用显色剂或紫外光灯 21吸附原理解读固液吸附三要素组成吸附剂溶质溶剂吸附剂溶质1溶质2溶质3溶剂吸附-解吸附过程影响因素吸附剂的极性溶剂的极性化合物极性极性大小是影响吸附主要因素硅胶无机硅胶是一种高活性吸附材料，用硅酸钠和硫酸反应，并经老化、酸泡等一系列后处理过程而制得，硅胶属非晶态物质，其化学分子式为mSiO2 nH2O；难溶于

11、水常用于分离的种类：硅胶G；硅胶GF254 ；硅胶H 粒度：具有不同粒度（200300目或100目）应用范围广泛，但分离生物碱易产生拖尾现象氧化铝 Al2O3白色晶状粉末 分类：中性氧化铝和碱性氧化铝常用碱性氧化铝：适于分离生物碱或中性亲脂性成分（甾、萜类）不适用于酸性成分（含酚羟基或羧基）（为什么）吸附剂与被吸附成分发生死吸附而难以解吸附 均为极性吸附剂硅胶与氧化铝吸附特点 对极性物质具有较强的亲和能力。 故同为溶质，极性强者将被优先吸附 溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出超强的吸附能力 溶剂极性增强则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱 溶质即使被硅胶、氧化铝吸附 但一旦加入极性较强的溶剂时

12、以可被后者置换洗脱下来如何理解被分离成分-吸附剂-展开剂（洗脱剂）的关系利用吸附剂对被分离混合物中各成分的吸附能力不同进行分离吸附解吸附化合物极性越大，Rf值越小实验课实验结果分析分析不同展开剂对Rf值的影响吸附剂：硅胶G展开剂：石油醚（ ）-乙酸乙酯 （4:1） （9:1）显色剂：5%香草醛硫酸溶液极性及其强弱总结化合物结构R-COOHAr-OHR-OHR-NH2, R-NH-RR-CHOR-CO-RR-COO-RR-O-RR-XR-H高级脂肪酸与葡萄糖极性大小比较酸性、碱性及两性化合物的极性受分子状态的影响化合物的极性由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合原因影响溶剂极性：与偶极矩

13、、极化度及介电常数等概念相关吸附法分离的应用需要解决问题1.吸附剂的选择2.吸附剂与样品用量3.色谱柱规格与装柱4.上样5.洗脱剂选择及洗脱吸附剂的选择：避免死吸附，如酸性物质不适合选择氧化铝 吸附剂与样品量：吸附剂用量一般为试样3060倍； 试样极性小，难分离可提高到100200倍色谱柱规格：高度与直径比（15:1）-（20:1）上样：用溶剂极性小的试剂溶解样品；如果溶解度不好，可先用极性大溶剂溶解 再用少量硅胶拌匀，并在低温下挥散，置五氧化二磷干燥器中干燥，研粉 后铺在吸附柱上洗脱：洗脱剂的极性应逐步增加，跳跃不能太大，多用混合溶剂洗脱剂如何筛选：可通过薄层系统筛选，一般TLC展开时使组分

14、Rf值 达到0.20.3的溶剂系统，可选择柱色谱分离该组分的最佳溶剂系统聚酰胺聚酰胺( PA，俗称尼龙) 是美国DuPont 公司最先开发用于纤维的树脂，于1939 年实现工业化。它是由一系列的酰胺基团聚合而成的一类高分子化合物，按其性质可分为两大类: 非反应性或中性聚酰胺及反应性聚酰胺。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂对碱较稳定对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66 聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键( -CO-NH-) 的高分子聚合物酰胺基团上的O、N 原子在酸性介

15、质中结合质子而带正电荷 -以静电引力形成吸附溶液中的阴离子与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基（或羧基）的化合物形成氢键而被吸附-而与不能形成氢键的化合物分离聚酰胺分离示意图33聚酰胺的薄层色谱条件被分离物质酚类、酸类、醌类、黄酮类等含酚羟基（或羧基）化合物吸附剂聚酰胺薄膜聚酰胺色谱柱展开剂或洗脱剂水/甲醇/丙酮/稀氢氧化钠甲酰胺比较硅胶与聚酰胺分离的相同点和不同点聚酰胺不适合分离哪类成分？34液-液分配柱色谱（与萃取法比较）将两相溶剂中一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中 加入与固定相不相混溶的另一相溶剂,作为流动相物质在两相溶剂中相对做逆流移动在移动过程中不断进行动态分

16、配而得以分离上述方法称为液-液分配柱色谱 35正相分配色谱固定相极性大于流动相固定相：水或缓冲溶液色谱用载体主要有硅胶硅藻土及纤维素（粉）流动相：三氯甲烷 乙酸乙酯 丁醇等反相分配色谱固定相极性小于流动相固定相：石蜡油色谱用载体主要有硅胶硅藻土及纤维素（粉）流动相：水、甲醇等正相分配色谱与反相分配色谱流动相的极性小于固定相极性Paper chromatography (PC)-水 展开剂：正丁醇-醋酸-水（4:1:5)上层 比较：（1）芦丁和槲皮素Rf值（2）glc和rha Rf值正相分配色谱流动相的极性大于固定相极性固定相：十八烷基硅胶（ODS）或C8键合相流动相：甲醇-水/乙腈-水反相分配

17、色谱38正相分配色谱与反相分配色谱新型固定相将硅胶经过结构修饰，键合上长度不同的烃基（R）形成亲脂性表面而成种类根据烃基（-R）长度为乙基、辛基或十八烷基，分别命名为RP（reverse phase)-2 RP（reverse phase)-8（辛烷键合硅胶） RP（reverse phase)-18（ODS） （十八烷基硅烷键合硅胶）亲脂性比较： RP-18 RP-8 RP-239加压液相色谱（HPLC）经典液相色谱载体颗粒较大（硅胶 100150m）流动相靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液人工收集再分段分析柱效相对低分离时间较长加压液相色谱柱效增加载体颗粒较小（硅胶），机械强度大及比

18、表面积大如有薄壳型或表面多孔型硅球，其上可键合不同极性化合物，衍生出多种极性吸附剂 提高分离速度 缩短时间 通过施加不同压力快速色谱（flash chromatography)低压液相色谱（LPLC) 高压液相色谱（HPLC)高效液相色谱（HPLC)40高效液相色谱仪41涡流色谱分离生物样品的新技术利用大粒径的填料，使流动相在高流速下产生涡流状态从而对生物样品进行净化与富集流速高，但分离效果并没有降低在流动相中，溶质分子都存在浓度趋同均一扩散，涡流作用增加溶质在柱内浓度梯度的变化，使分子扩散加快高流速的流动相在柱内形成漩涡，会加快溶质分子从流动相到固定相传质主要模式：单柱模式、双柱模式及多柱模

19、式单柱模式，涡流色谱柱与检测器相连，完成样品净化双柱模式：增加分析柱，主要完成富集多柱模式：多个涡流色谱柱通过切换阀与分析柱相连，可实现不同目的高通量 样品的分析42大孔吸附树脂结构与组成 以苯乙烯等为原料，加入致孔剂甲酰胺聚合而 成 多为白色球状颗粒性质：在溶剂中溶胀，室温下对稀酸、稀碱稳定分离原理：以吸附性与分子筛相结合的分离材料， 吸附力是范德华力或氢键吸附 分为非极性、弱极性和中极性43大孔吸附树脂操作步骤：预处理：用乙醇、水处理上样：试样制成水溶液洗脱：先用水洗；再用极性由低到高的不同浓度乙醇洗脱树脂再生：通过酸碱处理可再生使用大孔吸附树脂是一类没有可解离基团、具有多孔结构、不溶于水

20、的固体高分子物质吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料如经典分离糖与苷类化合物、生物碱的精制等操作见人参皂苷类成分分离实验441.树脂型号 -比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键，即树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、孔容）影响大孔树脂分离的因素2. 被吸附化合物性质如分子量大、极性小的化合物与 非极 性树脂吸附作用强3.洗脱剂极性小、洗脱力强；可以用酸碱性洗脱剂4.pH值影响对于酸碱性化合物选择大孔树脂分离5.温度物理吸附过程，温度低不利于吸附6.其他洗脱液流速、树脂粒径、树脂柱的高度45凝胶过滤色谱（排阻色谱、分子筛色谱）凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质根据混合物中各成分分子大小进行

21、分离含有不同分子大小的组分样品进入凝胶柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔内只能分布在凝胶颗粒的间隙中以较快的速度流过凝胶柱成分流出色谱柱的顺序：大分子最先流出；其次 中等大小； 最后小分子判断小分子行为？葡聚糖凝胶(Sephadex G)型号Sephadex G 由葡聚糖和甘油基通过醚桥（-O-CH2-CHOH-CH2O-) 相交联而成的多孔性网状结构，具亲水性，在水中溶胀Sephadex G -100含义： Seseparation （分离）的缩写；pha医药公司的缩写 Se是separation （分离）的缩写；pha是医药公司的缩写；dex是葡聚糖的缩写；G是凝胶gel字

22、头；25代表1g干胶可吸取2.5ml水dex葡聚糖的缩写；G凝胶gel字头100代表1g干胶可吸取10ml水葡聚糖凝胶(Sephadex )性质交联度与吸水性凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联度的数量和反应条件交联度与加入交联剂量有关，加入交联剂越多，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀越小，反之Sephadex G 只适用在水中应用 适用条件Sephadex G 只适用在水中应用Sephadex LH-20 在 Sephadex G-25的羟基上引入羟丙基而成醚键的结合态二者差别是羟基总数不变，但碳原子数增加Sephadex LH-20适用在水中、有机溶剂或它们与水组成混合溶剂（醇）中应用型号 吸水量

23、 (ml/g） 床体积 (ml/g） 分离范围(分子量） 蛋白质 多糖最少溶胀时间室温 沸水浴G-101.00.123 700 700 3 1G-252.50.24610001500 1005000 6 2G-505.00.3911150030000 50010000 6 2G-100G-150G-200Sephadex G 的性质 50离子交换树脂分离材料分离原理51 生物碱：氧化铝、硅胶或离子交换 苷类：皂甙、强心甙用硅胶吸附、分配色谱及大孔吸附树脂 挥发油、甾体、萜：硅胶或氧化铝吸附色谱 黄酮类、鞣质等多元酚：聚酰胺或硅胶吸附色谱 有机酸、氨基酸：离子交换、分配色谱、活性炭吸附 大分子化

24、合物：蛋白质、多糖用凝胶色谱 、大孔吸附树脂各类成分色谱分离可选择吸附剂52*在水中不溶但可膨胀的分离材料是A.葡聚糖凝胶 B.氧化铝 C.硅胶 D.透析膜 E.活性炭*凝胶过滤法的洗脱顺序为A.极性小者先洗脱下来 B.极性大者先洗脱下来 C.分子量大者先洗脱下来 D.分子量小者先洗脱下 E.羟基数目少者先洗脱下来测试题53*16.高效液相色谱的缩写符号为A.TLC B.GC C.PC D.HPLC E.MS17. 常用反相色谱柱的主要填料是A.硅胶 B.RP-2，RP-8，RP-18 C.氧化铝 D.聚酰胺 E.纤维素18. 离子交换树脂的交联度越大则A.网孔越小，质地越紧密，在水中易于膨胀

25、B.网孔越大，质地越紧密，在水中易于膨胀C.网孔越小，质地疏松，在水中越不易膨胀D.网孔越大，质地疏松，在水中越不易膨胀E.网孔越小，质地越紧密，在水中越不易膨胀5420. 根据操作方式不同，色谱法主要形式有A. HPLC和中压液相柱色谱B. 柱层色谱，薄层色谱、纸层色谱C.硅胶和聚酰胺色谱D.离子交换色谱和氧化铝色谱E.正相色谱和反相色谱21. Sephadex G（葡聚糖凝胶）多用于分离多糖、 蛋白质、多肽等化合物， 其只适于在什么溶剂中进行A.碱水 B.水 C.乙醇 D.甲醇 E.正丁醇55不适合选择离子交换法分离的成分A.生物碱 B.有机酸 C.生物碱盐 D.强心苷 E. 氨基酸A.液-液萃取法 B.沉淀法 C.硅胶色谱法 D.聚酰胺色谱法 E.离子交换色谱法1.根据物质形成氢键能力不同进行分离得方法是2.根据物质溶解度不同进行分离的方法是3.根据物质在两相互不相溶的溶剂中的分配系数不同进行分离的方法是56A.分离因子 B.比表面积 C.介电常数 D.比旋光度 E.熔距1.影响纸色谱分离的主要因素是2.影响大孔树脂吸附的主要因素是3.判定溶剂的极性大小是57A.阳离子交换树脂 B.透析膜 C.活性