浅析甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术

1、浅析甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术摘要：利用小孢子加倍培养技术可以培育基因纯合、稳定的遗传材料,掌握该技术对加速育种进度有重要意义。从选取花蕾、游离小孢子别离、小孢子加倍培养、胚诱导培养、胚状体培养、再生苗培养、再生植株倍性鉴定等方面总结了甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术。关键词：甘蓝型油菜;小孢子;加倍培养自lihter等11981年首次报道了甘蓝型油菜游离小孢子培养并成功获得了再生苗,在后来的20多年里,国内外学者已经成功地在甘蓝型油菜中建立了小孢子培养技术体系,特别是用此种方法从培育的dh群体中获得的多种油菜品种已经在消费中得到了广泛的认可。现将甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术介绍如下。1选取花蕾

2、一般在天气晴朗的810时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.53.5的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽一样,可以剥蕾挑取小孢子进展镜检以确定发育时期,最正确时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后假如不能立即进展小孢子的提取,应将花蕾放置于潮湿的条件下低温保存。2游离小孢子别离先用75%的医用酒精将花蕾外表灭菌3060s,再用0.1%升汞消毒花蕾外表15in,再用无菌水冲漂洗3次,每次5in。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2lb5

3、提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45的尼龙网,或0.22孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10l离心管里,用滴管吸b5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲23次后,在10l离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rp,离心5in;将离心管中的上层清液吸去,再加液体b5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1800rp,离心5in,吸去上层清液。3小孢子加倍培养将沉淀的花粉用nln-16液体培养基稀释,稀释不要超过10l,因为加倍后还要在10l的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32条件下暗培养2d左右(4872h

4、);然后检查是否有污染,假如没有污染,那么分皿继续培养。4胚诱导培养将加倍后的nln-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rp,离心5in,倒掉nln-16液体;将沉淀的花粉用nln-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5培养皿,一般每皿参加悬浮液3l左右,含花蕾1.52.0个/l,小孢子密度为1050万个/l,用封口膜封口;将封口的培养皿在25的条件下进展暗培养,10d左右开场查看是否有可见的颗粒状胚,假如没有那么继续培养2。5胚状体培养当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养57d,转速为80100rp。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到b5固体培养基上,在25光暗交替条

5、件下持续培养,诱导植株再生3。6再生苗培养培养12周后,见到子叶长大变绿,胚根伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当到达34片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1g/l6-ba的b5培养基上进展扦插繁殖,获得完好植株。7再生植株倍性鉴定对再生植株进展细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进展鉴定4-7。假设是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%0.4%秋水仙碱溶液泡1.58.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10

6、100g/l秋水仙碱的b5液体培养基中无菌培养48d,转到无秋水仙碱的b5培养基中培养714d,然后移栽到土壤中8,9。8参考文献1rdutinfhaplidplantsfrislatedpllenfbrassianapuslj.zpflanzenphysil,1982(105):427-434.2石淑稳,周永明,吴江生,等.甘蓝型油菜小孢子培养、染色体加倍、试管苗继越夏和田间移栽配套技术的研究及其在油菜育种中的应用j.中国农学通报,2001,17(2):57-59.3余凤群,刘后利.进步甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究j.作物学报,1997,23(2):165-168.4祁永琼,林良斌.油菜小孢子再生体系的研究进展j.云南农业大学学报,2022,18(2):208-211.5姜凤英,冯辉.羽衣甘蓝游离小孢子培养初报j.园艺学报,2022,32(5):884.6石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究j.中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.7汤清林,宋明,张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展j.西南农业学报,2000,13(3):98-103.8张德双,曹鸣庆,秦智伟.绿菜花游离小孢子培养、胚