基于CHO细胞的单抗生产

1、基于CHO细胞单抗生产（第一版） 汪洋/02第1页07:44提升原料药出料工序收率2/40CHO细胞构建CHO细胞表示CHO细胞表示后产物纯化目录第2页07:443/40第一节 CHO细胞构建第3页生物类似药开发周期表第4页引言07:445/40在获取一种蛋白之前，先要找到该蛋白的基因序列，我们知道了它的名字，就可以到数据库里进行搜索。有很多免费的数据库资源，比如NCBI。 找到蛋白，再找到它的DNA序列。 然后针对这段序列设计引物，找到模板或基因组，用PCR的方法扩增出来把扩增出来的基因放到载体上，通过一定的方式如电刺激使得载有可表达目标蛋白的载体进入到细胞内部由于转入细胞核的质粒有很小的概

2、率（亿分之一）整合进宿主的基因组中，所以可以用加压筛选的手段（主要有抗生素）将这种细胞筛选出来并扩大培养，这样就得到了可以稳定表达目标蛋白的细胞株工程细胞构建流程概述第5页细胞株筛选普通流程宿主细胞载体筛选第6页CHO细胞系宿主普通起源FUT8（ -1,6岩藻糖转移酶基因），负责将岩藻糖加入抗体N-糖链上，形成岩藻糖修饰 （专利日本BioWa制药，预计2028.07.09）。去除岩藻糖修饰能够增强百倍以上ADCC作用。2. crispr/cas9原理是 ：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）经过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形

3、成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配正确序列靶位点剪切双链 DNA。而经过人工设计这两种 RNA，能够改造形成含有引导作用sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 定点切割。3.锌指核糖核酸酶（ZFN） 由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶组成。第7页宿主细胞选择普通标准第8页Regulatory-Host cell lineIND提供CHO已知含有显著致瘤性，普通可不再检测宿主细胞选择普通标准第9页载体普通性组成主要构件：IRES起始位点Promoters开启子Enhancer增强子

4、Signal peptide信号肽mAb Sequence 单克隆抗体序列Terminator终止子 Resistance markers 抗性标识 Expression promoting element 促稳定表示件第10页载体普通性组成1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA5端开始，因为翻译起始必须依赖于5端帽子结构。2、Promoters：即开启子，控制基因表示（转录）起始时间和表示程度，开启子本身并不控制基因活动，而是经过与称为转录因子

5、（transcription factor）这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动 抗体序列需使用强开启子如SV40开启子等 而抗性基因需要使用减弱开启子3、Enhancer：即增强子，是指能够使基因转录频 率显著增加 DNA序列。增强子主要存在于真核 生物基因组中。 增强子能大大增强开启子活性。 增强子含有特异性第11页载体普通性组成 4、Signal peptide：即信号肽（引导新合成蛋白质向分泌通路转移短肽链） 不一样产物可能需要不一样信号肽，抗体普通可使用人血白蛋白信号肽，取得较高表示量，且能被完全切除 普通需要进行信号肽预测优化，选择适当信号肽， 在蛋白质分泌到胞外之前正

6、常情况下会被完全切除 信号肽假说认为，信号肽功效是引导多肽抵达内质网内腔，同时信号肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAb Sequence 人源化IgG1恒定区（ CH和CL ）有EM和DL两个版本，区分是两个位点氨基酸有突变 Biosimilar: 检索原研药专利取得VH和VL序列，并购置原研药进行序列分析比对，进行序列验证 Category1ofTherapeuticBiologicalProducts: Hybridoma technique 杂交瘤筛选 Phage display 噬菌体展示第12页载体普通性组成6、 Terminator ：终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号DN

7、A序列。在一个操纵元中最少在构基因群最终一个基因后面有一个终止子。7、 Expression promoting element:即促表示元件 例：UCOE:全称为泛染色质开放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element），加在外源基因开启子5端上游，是一个小DNA片段，源于看家基因无甲基化CpG岛。研究表明，UCOE能有效预防基因缄默，不论整合到染色质什么位置，目标基因都能连续稳定、高水平地表示。 Merck KGaA 专利，预计.07.20到期 第13页载体构建普通性标准第14页构建完细胞筛选非扩增基因扩增基因：在一定程度上表示量随筛选压力而增加可选其中一

8、个或选其中任意两种，使用两种需要关注HC和LC百分比（LC形成二聚体能够分泌到胞外）第15页筛选方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening基于荧光激活细胞分选(FACS)技术 筛选方法ClonePix /Cell Xpress TM 克隆筛选及细胞表示系统Limiting dilution 有限稀释法 第16页筛选方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening The cold capture method used in FACS where

9、 fluorescently labeled antibodies bind to secreted 将待测细胞经荧光染料(FITC、 PE和PerCP等）或荧光标识物特异性染色, 用特定波长激光束照射, 激发荧光。 前向角光散射(forward angle light scatter, FSC)和侧向角光散射(side angle light scatter,SSC)分别表征细胞相对大小和内部颗粒度, 相对荧光强度值能反应细胞目标相对表示水平光源第17页筛选方法ClonePix Semi solid media 第18页筛选方法Limiting dilution 有限稀释法(limiting

10、 dilution cloning, LDC)是一个经过梯度稀释以取得单克隆方法。 它应用范围广, 对于大多数细胞类型, 如杂交瘤细胞、 CHO细胞及干细胞等都有很好克隆分离效果。 LDC操作过程大致分为接种(铺板)、 筛选和扩增。 接种细胞液经过逐层稀释后加到96孔板中, 每个孔所含细胞个数理论上小于1 第19页有限稀释法 Expression VectorHost cellTransfectionMinipoolStable poolSmall-scal BioreactorMonoclonalSubclone一二SubcloneSmall-scal Bioreactor第20页转染转染

11、脂质体转染法：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸磷酸根经过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电细胞膜吸附，再经过融合或细胞内吞进入细胞。因为脂质体对细胞有一定毒性，所以转染后需要更换培养基。如Lipofectamine 3000 Transfection Reagent，普通用于瞬时转染，因转染后细胞活率较高，也有部分企业用于稳转。 电穿孔转染法：电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。因使用便捷且转染（入核）效率较高， 大部分企业使用电转染。电转染有两种方案：方形波和指数波，依据实际情况选择适当波形进行优化，

12、选择转染效率和转染后细胞活率较高电转条件。CHO细胞选取电转较多。 病毒感染：对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染细胞系提议用病毒感染，此法能够快速100%感染，检测成功率高。因操作难度高，使用较少。第21页克隆筛选一、Minipool 转染24H后,使用含有压力培养基，以一定细胞密度接种到96WP,培养14-20天， 挑选出只有单簇细胞生长且汇合度超出30%孔，ELISA检测表示量，挑选表示 量较高若干个克隆 96WP24WP6WPELISATPPSF125接种F125进行Fed-Batch评定，检测表示量和质量，选择产量和质量最优3-5个克隆MonoclonalELISA 、SDS(还

13、原与非还原)表示量检测还可用：Dot-blot、FortebioELISA第22页克隆筛选二、 Stable pool 转染24H后,使用含有压力培养基，以一定细胞密度接种到T75或F125,加压 一定时间（依据使用筛选压力），得到若干个Stable pool，用ELISA（或 FACS ）检测，选择表示量（或阳性率和高表示）1-2个Stable pool进行单 克隆化 Stable pool96WP24WPTPPSF125接种F125进行Fed-Batch评定，检测表示量和质量，选择产量和质量最优3-5个克隆Monoclonal以1-3个/孔铺板96孔板进行单克隆化，普通不添加筛选压力或者使

14、用半压6WPELISAELISAELISA 、SDS(还原与非还原)第23页单克隆在细胞克隆中，对培养细胞来说，从原有克隆中，再筛选出含有某种特征细胞进行培养，就是亚克隆。亚克隆目标是取得单克隆CFDA-当前来说只要理论上证实是单克隆FDA- Clonality Limiting dilution ：classic 0.5cell/well 2 roundsCSI/Cell Metric第24页单克隆拍照系统第25页FDA当前对于单克隆证实方法意见第26页克隆性FISH不但可用于已知基因或序列染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标识及染色体畸变研究。在基因定性、定量、整合、表示等方面研究中

15、颇具优势。第27页筛选检定第28页细胞代次要求第29页细胞库相关法规要求第30页细胞库相关法规要求1、程序性降温仪：可编程降温程序，能够准确到达设定温度，重复性。稳定性好，适合于细胞建库使用2、程序降温盒：需在降温盒夹层加入异丙醇，可实现-1/ min，每个冻存盒普通可放16支，比较适合用于试验室规模标准冻存程序：为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可快速浸入液氮中。也可将装有细胞冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。第31页细胞库相关法规要求冻存容器：（供给商:CBS、MVE、 Thermo

16、 Fisher Scientific ）普通液氮罐：直接冻存在液态液氮中，很轻易引发交叉污染气化液氮罐：液氮存于罐底部，经过底部液氮气化维持温度隔氮型液氮罐：液氮贮存于夹层中，与样品完全隔离，取用安全且将交叉污染可能降到最低第32页细胞库相关法规要求第33页细胞库检定第34页细胞库检定-CHO细胞检测项目MCPWCPEOPC细胞判别+(+)细菌、真菌检验+分歧杆菌检验+支原体检验(+)(+)(+)内、源病毒污染检验细胞形态观察及血吸附试验+体外不一样细胞接种培养法+动物和鸡胚体内接种法+-+逆转录病毒检验+-+种属特异性病毒检验（鼠源）(+)-牛源性病毒检验(+)(+)(+)猪源性病毒检验(+

17、)(+)(+)其它特定病毒检验(+)(+)(+)染色体检验(+)(+)(+)成瘤性检验(+)(+)-致瘤性检验(+)(+)-( +) 表示要依据细胞特征、传代历史、培养过程等情况要求检链项目。 第35页细胞库稳定性考查细胞稳定性研究储存条件下稳定性传代/扩增过程稳定性基因水平目标产物表示水平细胞本身稳定性第36页细胞库稳定性考查储存条件下稳定性属于原液放行检定项目第37页细胞库稳定性考查传代/扩增过程稳定性第38页经过细胞构建降低表示杂质案例CHOK1 cell Expression of antibody A Acidic variants: NMT 14.0%Basic variants:

18、 NMT 30.0%USP Acceptance criteriaAcidic variants: NMT 35.0%Basic variants: NMT 15.0% Originaldrugs Acidic variants: NMT 10.0%Basic variants: NMT 10.0%第39页游离巯基、半胱氨酸残基N-末端谷氨酰胺环化甲硫氨酸氧化天冬酰胺脱氨基作用和天冬氨酸异构化C-末端赖氨酸不完全截除糖基末端唾液酸化抗体电荷异质性主要成因碱性峰碱性峰碱性峰酸性峰酸性峰酸性峰第40页重链C-末端赖氨酸不完全截除碱性峰羧肽酶是移除C-赖氨酸酶可用弱阳离子层析检测分析降低赖氨酸变体策

19、略：降低细胞培养温度延长发酵时间提升锌离子浓度降低铜离子浓度重链和轻链 N-末端谷氨酰胺环化可被谷氨酰胺环化酶催化但在抗体储存过程中，环化作用是自发可用基于电荷分析方法，如 IEF、CEXpH 4 6，pH升高环化降低pH 6 8，pH升高环化增加在中性条件下环化作用最少降低谷氨酰胺环化策略：尽可能选择中性条件控制温度（高温条件可加速环化）甲硫氨酸氧化碱性峰主要位点：M252、M428检测：先还原成HC+LC，联苯层析柱 加 UV215nm 加 质谱降低甲硫氨酸氧化策略：防止高温、紫外线、叔丁基过氧化氢，溶氧不要过高碱性峰焦谷氨酸氨肽酶去环化，释放自由氨基，可恢复基于Edman降解法N-末端氨

20、基酸测序第41页糖基末端唾液酸化酸性峰常发生在糖链末端半乳糖残基上可用唾液酸酶去除，用IEF、CEX检测抗体生产追求NeuAc /NeuGc百分比最大化最大化策略：+丁酸钠，下调培养温度NeuAc /NeuGc测定方法：HPLC、MS、IEF 唾液酸酶去除唾液酸前后对比天冬酰胺脱氨基作用酸性峰可自发发生，无需酶催化检测：人为加速脱氨基 （37C，pH8） 之后用 CEX，HIC降低脱氨基作用策略：尽可能防止热点序列 Asn-Gly降低培养温度，适当下调pH游离巯基、半胱氨酸残基酸性峰抗体二硫键可能未配对或配错对，造成抗体表面电荷分布改变和酸性峰出现用木瓜蛋白酶把完整抗体解离成Fab和Fc后，用

21、RP-HPLC可检测到游离巯基降低游离巯基、半胱氨酸残基策略：在培养基中加适量硫酸铜（氧化剂）第42页有研究发现 ，单克隆抗体 C-末端残留赖氨酸在静脉注射至体 内后 ，会被血清中羧肽酶 B 快速降解 ，完整 C-末端赖氨酸半衰期约为 62 min。另有研究发现 ，从血清中获得抗体通常均缺少C-末端赖氨酸，也从其次证实 了C-末端赖氨酸残基在体内是受到限制。 K H A W LI等 经过置换色谱法分别制备 出酸碱变体 ，并对其进行评价 ，发现 C-末端赖氨酸变体对抗体 效价 、安全性均无影响。重链C-末端赖氨酸尽管 C-末端赖氨酸变体对单克隆抗体 生物学活性无影响 ，但抗体赖氨酸变体程度也反

22、映了生产工艺稳定性和产品一致性 ，尤其在生物类似药研发过程中和生产工艺改变后 ，更应对产 品赖氨酸变体进行检测和评价 。 所以 ，在生产工艺研发 中 ，应严格监控 C-末端赖氨酸变体 ，并深入了解其与产品质量和安全性关系。 单克隆抗体大规模生产时 ，赖氨酸变体应控制在可行范围内，并评定是否需作为在产品放行 、稳定性试验和工艺改变时一项检测指标。 第43页第二节 CHO细胞表示第44页07:4445细胞培养基本要求细胞组成基本元素：碳、氢、氧、氮、钠、钾、钙、镁、磷，适当培养基是细胞培养必要条件1.氨基酸：是细胞合成蛋白质原料。全部细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、

23、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。另外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有主要作用，所含氮是核酸中嘌令和嘧啶合成起源，一样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要基本物质。 体外培养各种培养基内都含有必需氨基酸。小花絮：经过几万年动物进化，自然选择结果，动物体内全部氨基酸都左旋，所以右旋氨基酸是不能用于细胞培养第45页07:4446细胞培养基单糖：培养中细胞能够进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。另外六碳糖也是合成一些氨基酸、脂肪、核酸原料。细胞对葡萄糖吸收能力最高，半乳糖最低。 体外培养动物细胞时，几乎全部培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含能源物质。 蛋白质一级结构维系键是肽键，二级结构借氢键维系，三级

24、结构维系键主要是非共价键（次级键）：氢键、疏水键、范德华力、离子键等，也可包括二硫键。这些键形成主要依靠CHON，所以糖和氨基酸是细胞培养基中最主要组成部分第46页07:4447细胞培养基维生素：主要饰演辅酶、辅基角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有成份。第47页07:4448细胞培养基无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒、硫等。 微量元素即使在细胞体内含量非常非常少，却是蛋白质四级结构中非常主要维系键形成关键元素，对于药品而言该四级结构控制着药代、药理相关过程

25、第48页07:4449促生长因子及激素 已证实：各种激素、生长因子对于维持细胞功效、保持细胞状态（分化或未分化）含有十分主要作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有显著促进作用，如氢化可松可促进表皮细胞生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。细胞培养基第49页07:4450细胞培养基本要求渗透压 ：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg范围都

26、适宜。 pH 、气体 也是细胞生存必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参加三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成份。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，普通置细胞于95空气加5二氧化碳混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成份，它主要与维持培养基pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微碱性条件，pH值约在7274在细胞生长过程中，随细胞数量增多和代谢活动加强，二氧化碳不停被释放，培养液变酸，PH值发生改变。因为NaHCO3轻易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以准确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。第5

27、0页07:4451CHO细胞性质中华仓鼠卵巢细胞（CHO）是治疗性重组蛋白工业化生产主要宿主细胞。较于其它细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产主要宿主细胞原因以下：（1）能在化学成份限定和无血清悬浮培养中稳定生长，（2）在人类致病病毒应答方面表现出合理安全性，（3）能够表示与人相同翻译后修饰。另外，CHO细胞表示系统最主要优势之一是能够轻易得到基因改造细胞克隆，这些克隆能够表示产量充分和质量可接收人用目标基因（GOI）蛋白。这些既能够经过将目标基因特异性位点整合插入到宿主细胞基因组中，也能够经过二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系统基因扩增方法将基因随机整合到宿主细胞基因组中。

28、然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，造成CHO细胞产生重组蛋白在一些时候依然表现出免疫源性。第51页07:4452单抗性质抗体是由B细胞分泌，含有识别外源性病原体并诱发免疫应答一类糖蛋白，人体内有5种类型抗体：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，其中IgG1 在血液中占主导地位第52页07:4453当前全部获批重组单抗药品都是IgG 亚型FabFc铰链区单抗性质第53页07:4454CHO细胞表示单抗过程细胞核中DNA转录成为信使RNA，信使RNA经过核孔进入细胞质，被细胞质中核糖体发觉，进入核糖体进行翻译，经过原料氨基酸合成为多肽，（cho细胞不能本身无合成脯氨酸基因，需在培养基中加L

29、-脯氨酸），核糖体附着在内质网上，核糖体合成多肽进入内质网，被内质网上附着大量酶加工、剪切，最终内质网分泌囊泡将被加工过多肽包裹运输到高尔基体，高尔基体进行深入修饰，形成蛋白质。然后高尔基体分泌囊泡包裹蛋白质，将蛋白质运输到胞外 表示蛋白过程概述第54页07:4455CHO细胞表示单抗过程第55页07:4456CHO细胞表示单抗过程真核细胞中染色质分为两部分，一部分为固缩状态，如间期细胞着丝粒区、端粒、次溢痕，染色体臂一些节段部分重复序列和巴氏小体均不能表示，通常把该部分称为异染色质。与异染色质相反是活化常染色质。真核基因活跃转录是在常染色质进行。转录发生之前，常染色质往往在特定区域被解旋或松

30、弛，形成自由DNA，这种改变可能包含核小体结构消除或改变，DNA本身局部结构改变，如双螺旋局部去超螺旋或松弛、DNA从右旋变为左旋，这些改变可造成结构基因暴露，RNA聚合酶能够发生作用，促进了这些转录因子与开启区DNA结合，造成基因转录第56页07:4457真核生物基因转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质中进行。在转录过程中真核基因有插入序列，结构基因被分割成不一样片段，所以转录后基因调控是真核生物基因表示调控一个主要方面，首要是RNA加工、成熟。各种基因转录产物RNA，不论rRNA、tRNA还是mRNA，必须经过转录后加工才能成为有活性分子蛋白质合成翻译阶段基因调控有三个方面： 蛋白质合成起

31、始速率调控； mRNA识别； 激素等外界原因影响。蛋白质合成起始反应中要包括到核糖体、mRNA蛋白质合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，这些结构友好统一才能完成蛋白质生物合成。mRNA则起着主要调控功效。CHO细胞表示单抗过程第57页07:4458CHO细胞表示单抗过程真核生物mRNA“扫描模式”与蛋白质合成起始。真核生物蛋白合成起始时，40S核糖体亚基及相关合成起始因子首先与mRNA模板近5端处结合，然后向3方向移行，发觉AUG起始密码时，与60S亚基形成80S起始复合物，即真核生物蛋白质合成“扫描模式”。真核生物5末端能够有3种不一样帽子：0型、I 型和 II 型。不一样生物mRAN可有不一

32、样帽子，其差异在于帽子碱基甲基化程度不一样。帽子结构与mRNA蛋白质合成速率之间关系亲密： 帽子结构是mRNA前体在细胞核内稳定原因，也是mRNA在细胞质内稳定原因，没有帽子转录产物会很快被核酸酶降解； 帽子能够促进蛋白质生物合成过程中起始复合物形成，所以提升了翻译强度； 没有甲基化(m7G)帽子(如GPPPN-)以及用化学或酶学方法脱去帽子mRNA，其翻译活性显著下降。第58页07:4459翻译后修饰如脱酰胺、二硫键形成、末端赖氨酸处理（切除）和糖基化，后者是一个发生在内质网和高尔基体内复杂翻译后修饰。依据作用机理，生物药品分子糖型可能决定了其临床疗效，所以糖基化修饰被认为是单抗药品一个关键

33、质量属性（CQA）CHO细胞表示单抗过程第59页 CQA：糖基化修饰N-糖位点 (ASN-X-Thr/Ser, X非Pro)O-糖位点 (任意 Thr 和 Ser)60O-糖基化N-糖基化（Enbrel-etanercept）第60页最主要形式O-糖基化类型常见8种粘蛋白类型O-糖关键结构常见粘蛋白类型O-糖质谱分子量61第61页N-糖基化类型62Hybrid杂合型High mannose高甘露糖型治疗性重组抗体常见N-糖基化组成重点关注对Fc功效影响和存在免疫原性糖型Complex复杂型第62页N-糖形成过程内质网高尔基体各种剪切酶（减去单糖）及转运酶（加上单糖）作用下对糖基化形式进行编辑6

34、3第63页N-糖基化对蛋白功效影响促进蛋白溶解度，一定程度预防蛋白聚集保护蛋白免受蛋白酶酶切可能引发免疫原性对ADCC、CDC等生物效应造成影响对体内循环半衰期有一定影响64影响蛋白质构象改变第64页65N-糖基化对蛋白构象影响铰链区影响分子构象“铰链区”存在为分子提供了柔性，使得Fab-Fc、Fab-Fab间能够有一定摆动。进而影响IgG空间构象，影响Fc片段活性区域与各种受体结合。N糖基化一样影响分子构象N糖基化位于Fc片段CH2共有序列 （Asn-X-Ser/Thr）经过晶体X衍射发觉蛋白与糖以对等方式相互作用而影响彼此构象N-Glycosylation siteFcRs(FcRIIa、

35、FcRIIb、FcRIIIa、FcRIIIb)FcRnC1q结合第65页ADCCAntibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity （抗体依赖性细胞介导细胞毒作用）1、IgG抗体与靶细胞表面抗原决定簇特异性地结合；2、之后NK细胞、巨噬细胞等借助其表面受体与结合在靶细胞上IgG Fc段结合；3、活化NK细胞等释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质杀伤靶细胞；4、靶细胞发生细胞凋亡，抗体被肝处理。66*与去岩藻糖化、唾液酸百分比等相关第66页CDCComplement Dependent Cytotoxicity （补体依赖性细胞毒作用）补体参加细胞毒作用，即经过

36、特异性抗体与细胞膜表面对应抗原结合，形成复合物而激活补体经典路径，所形成攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应67*与末端半乳糖化百分比相关第67页甘露糖受体功效甘露糖受体，属于哺乳动物类C型凝集素超家族组员,主要表示于巨噬细胞和未成熟树突状细胞表面, 可与末端甘露糖特异结合。高甘露糖型抗体因为可被巨噬细胞甘露糖受体结合并发生吞噬作用，所以在体内循环时间降低，半衰期减短，所以应尽可能降低抗体中高甘露糖糖型百分比。68*与高甘露糖型百分比相关第68页举例Additional Terminal ResidueEffect on receptor bindingEffect on ADCCEffect on

37、 C1q bindingEffect on CDCEffect on Half-life in Serum岩藻糖减弱减弱无影响无影响无影响唾液酸减弱减弱无影响无影响增强半乳糖无影响无影响增强增强无影响高甘露糖增强增强减弱减弱减弱N-乙酰葡糖胺增强增强减弱减弱未知末端寡糖反抗体活性影响Current Opinion in Immunology , 20:471478第69页07:4470细胞培养条件对于糖型影响补料成份抗体糖型取决于培养基中各营养物质浓度，营养物质中糖分子作为糖基化所需糖-核苷酸前体存在培养基中。培养基中葡萄糖水平改变显著影响聚糖异质性，在流加模式中更为主要，产品糖型一致性是取得

38、临床预期结果保障。已发觉，伴随葡萄糖浓度提升，CHO细胞及新近构建细胞系（如F2N78）所表示抗体半乳糖和唾液酸糖基化水平会提升葡萄糖适当操作区间浓度（2-8g/L）。葡萄糖饥饿程度在培养早期对细胞影响最大第70页07:4471细胞培养条件对于糖型影响二价阳离子如Mn2+（4-40M）能够发觉产物半乳糖苷化和唾液酸化提升。因为Mn2+是高尔基体中-1,4-半乳糖苷转移酶辅助因子。二价阳离子在分泌路径将寡糖连接至目标物中发挥作用，没有它们N型连接寡糖链过程将会受到抑制。补料成份第71页07:4472细胞培养条件对于糖型影响丁酸钠能够经过将细胞周期滞留而增加特定mAb产率，然后，在培养基中加入丁酸

39、钠观察到会降低半乳糖修饰水平并增加mAb碱性电荷异构体。添加丁酸钠也观察到会降低mAb唾液酸修饰水平补料成份第72页07:4473细胞培养条件对于糖型影响单糖连接至正在成长天线寡糖链结构中需要核苷酸糖作为供给者，其效率对最终糖型影响极深。尿苷被认为是合成糖-核苷酸结合体主要前体之一，所以影响产品质量。补料成份第73页07:4474细胞培养条件对于糖型影响培养基中补充氨基酸对唾液酸修饰影响已被很好地证实。氨基酸消耗直接与表示抗体所序列所含氨基酸种类相关。所以为了取得最正确产品质量，在培养过程中补充关键氨基酸并进行浓度分析是势在必行。这些还引导出了新词汇如“fermentanomics”出现，利用

40、1D1HNMR技术实时或近似实时监控补料成份与细胞代谢。利用多重变量数据分析评定mAb糖基化与过程变量及诸如氨基酸等原材料关系，从而对复杂糖基化过程产生更为深入了解。补料成份第74页07:4475细胞培养条件对于糖型影响对细胞最优培养温度可能不一定是细胞表示产物最优温度。低些培养温度（从37降至30-35）发觉能够使细胞滞留在G0/G1期，含有更高细胞活力和更少细胞凋亡。在低温度下发觉细胞内UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc数量降低。研究者证实mRNA水平提升（而非生长周期滞留）是低温下取得高产率背后原因。最近，经过关键糖分支酶研究对低温条件下mAb产品有了更加好了解。发觉这些酶下调造

41、成终产品糖链结构异常。细胞活力和温度第75页07:4476细胞培养条件对于糖型影响溶氧影响全部代谢过程都需要氧气，所以溶氧控制对优化细胞生长很主要。细胞表示糖蛋白/抗体糖型随溶氧（DO）水平改变而改变。在鼠CC9CC10细胞表示IgGmAb1时发觉半乳糖基化水平差异，低溶氧条件下半乳糖糖基化水平也低。这个似乎是因UDP-Gal低水平所致，因为葡萄糖分解路径造成半乳糖利用率下降。另外一个解释是早期形成重链间二硫键对要加入正在生长寡糖链半乳糖产生了空间位阻。不一样型号生物反应器，即使到达相同过程控制和溶氧条件，依然会对糖型有影响。利用杂交瘤细胞系（BCF2）进行一室缩小规模模拟溶氧张力（DOT）波

42、动培养，硕士物培养环境差异对mAb糖型影响。据报道，10%DO水平下培养三天线结构和唾液酸数量会增加。DOT对鼠杂交瘤细胞系HFN7.1生产IgG1糖型影响极深，DOT在10%-90%空气饱和度改变时，半乳糖和唾液酸最大改变量分别达20%和30%。短暂DOT改变对终产品质量有着显著影响。第76页07:4477细胞培养条件对于糖型影响氨和PH值氨是CHO细胞代谢谷氨酰胺或天冬酰胺时释放到培养基中有毒副产物。据知，氨水平增加会改变CHO细胞表示IgG糖型，因为铵根离子会升高高尔基体pH值并抑制与寡糖链相关酶酶活。对mAb生产而言，理想胞内氨浓度低于2mM，胞外浓度4-10mM。高尔基体pH微小上升

43、会造成-2,3-唾液酸转移酶定位错误，维持pH近中性会改变高尔基体形态。高pH会影响UMP电离状态，UMP是一个UDP-GlcAc转运子逆向转运物质，从而影响UDP-GlcNAc转运进高尔基体。氨水平增加一样显示出：高尔基体高pH时，引发半乳糖和唾液酸修饰降低，从而引发甘露糖修饰增加。氨也经过赔偿胞内核苷酸糖库平衡而影响抗体糖型（图 3）。已经有推论因为CMP-SiaT酶水平降低，氨水平提升阻止了唾液酸从胞质转运到高尔基体。更深入，从可用文件获知pH（理想pH6.8-7.8）对糖型显著影响与不一样表示细胞系相关，另有结果表明pH在不一样细胞系中对糖型微观异质性有影响。还有些研究者报道称人细胞系

44、中高pH会引发半乳糖修饰水平下降，另外一些人发觉杂交瘤细胞系中高pH引发IgG3半乳糖修饰水平增加。第77页07:4478渗透压细胞培养条件对于糖型影响渗透压是另外一个影响mAb生产、细胞生长和细胞活力关键过程参数。一定范围高渗（300-400mOsm/kg）有益，并被用来提升重组蛋白在CHO细胞中表示。添加碱、葡萄糖或其它补料会提升渗透压，从而影响产品质量和特殊mAb产品。长时间培养和培养基高渗透压会产生高甘露糖型抗体药品。第78页07:44提升原料药出料工序收率79原因正向影响负面影响锰离子在Mn2+浓度高时，IgGN-聚糖修饰含有高甘露糖型；IgG Man5糖型降低在有尿苷和半乳糖补充下

45、，半乳糖修饰水平高。葡萄糖高浓度葡萄糖与可产生前体相关，造成高水平半乳糖修饰和唾液酸修饰耗尽时，降低IgG位点占据；限制葡萄糖水平造成低水平糖基化。丁酸钠丁酸钠存在时，唾液酸水平微小下降；降低半乳糖修饰。氨/谷氨酰胺伴随氨水平增加，抑制半乳糖和唾液酸修饰。氨基酸伴随色氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸补充唾液酸修饰水平增加。培养基中高浓度天冬酰胺造成低半乳糖型修饰。血清无血清培养中糖型异质性低；无血清培养基中唾液酸修饰高&半乳糖类修饰低。细胞培养条件对于糖型影响小结第79页07:44提升原料药出料工序收率80原因正向影响负面影响氧DO水平波动会增加三天线型和唾液酸修饰。在低DO水平下IgG半乳糖修饰降低

46、；在低DO水平下半乳糖修饰降低而唾液酸修饰增加。pH低pH时，葡萄糖修饰&唾液酸修饰水平提升。伴随pH上升，末端半乳糖修饰降低&岩藻糖修饰增加；高pH时，半乳糖修饰水平下降。温度低温时，因为基因表示下调，造成mAb糖链结构成熟度下降。渗透压高渗时，增加Man5修饰水平。在高渗（420mOsm/Kg）时对糖型无显著影响；在较高渗透压时会降低岩藻糖修饰水平（在285mOsm/Kg时70%，345mOsm/Kg时40%）。细胞系因为二等分GlcNAc加入使得ADCC活性增加。在CHO细胞中缺乏对应糖基转运酶，缺失a-2,6-唾液酸；NS0细胞系增加a-1,3-半乳糖表位。细胞培养条件对于糖型影响小结

47、第80页07:4481细胞培养条件研究DOE普通在药品进入临床II期研究，产品开始进行商业规模生产时候，过程定性研究就要开启。这部分工作最少需要1215个月。完成过程定性研究工作后，才能开展工艺放大，技术转移和工艺验证等后续工作。过程定性（process characterization）是对生物制药生产过程进行系统研究，意在建立含有较强稳健性（robust），柔顺性（compliance）生产工艺，满足大规模工业生产对工艺开发要求。这部分工作包含，对大规模生产过程进行预先风险评定，研究过程操作参数对性能指标影响, 区分关键参数与非关键参数，确定操作参数控制范围,了解各操作参数之间交互作用等。

48、进行过程定性研究，假如在实际生产规模上进行试验，不但成本昂贵，而且不具操作性。当前主要采取“规模缩小模型”（sale down model），在试验室内利用小型化生物反应器完成过程定性研究。第81页07:4482细胞培养条件研究DOE在试验室里利用“规模缩小模型”完成商业规模生产过程定性研究，需要遵照严谨科学程序。首先，要对以往批次数据进行充分挖掘、分析，在此基础上，完成生产过程风险评定，依据各操作参数对过程性能指标影响程度，对其进行优先级别排序。建立能够充分模拟大规模生产过程“规模缩小模型”第82页07:4483细胞培养条件研究DOE在进行过程定性研究之前，首先需要对以往批次数据进行充分挖掘

49、分析。在此基础上，对生产过程不一样步骤（培养基、种子链及生产期）进行风险评定，这其中包含：潜在风险发生严重程度，风险发生几率，风险是否含有可检测性等。通常使用危害分析与关键点控制(HACCP) 、失败模式和影响分析（Failure mode and effects analysis）、因果图（cause-and-effect diagrams）等工具对以上过程要素进行风险评定。这其中FMEA是利用数字（1到10）对过程风险进行量化分级。MPN是综合评价风险严重程度，发生几率，以及风险是否含有可检测性进行综合评判。第83页07:4484细胞培养条件研究DOE第84页07:4485进行过程定性研究

50、，首先需要建立一个能够充分反应商业规模生产过程特点“规模缩小模型”。该模型能够在参数评价，工艺开发中，起到模拟商业规模生产效果。当然，建立好一个“规模缩小模型”后，需要对其“等效性”进行验证。开展此工作流程，首先确定需要进行规模缩小操作参数，找出其中关键参数，确定参数能够接收改变范围。进行规模缩小模型试验，判定该模型是否与其代表大规模培养工艺含有等效性。细胞培养条件研究DOE第85页07:4486细胞培养条件研究DOE细胞培养所包括到参数在进行规模缩小时，依据其缩小策略不一样，通常能够分为两类。一类与体积亲密相关，如工作体积、流加体积，搅拌和通气。一类是独立于体积参数，如pH、溶氧和温度。对过

51、程参数进行规模进行体积缩小时，非体积依赖型参数保持不变，体积依赖型参数则按照培养体积缩小百分比，进行线性递减。但在实际工作中，受反应器几何尺寸，液体表面体积比，以及操作可控能力等原因影响，一些体积依赖参数如反应器搅拌速率、通气流量又不能简单了解为线性递减第86页07:4487体积非依赖型参数过程温度pH 接种体积(v/v) for each step 流加策略氧气传递速率二氧化碳去除速率消泡策略细胞培养条件研究DOE第87页07:4488体积依赖型参数培养基灭菌前后体积改变流加速率空气流量氧气流量细胞培养条件研究DOE第88页07:4489细胞培养条件研究DOE举例：2L Applikon 生

52、化反应器模拟2,000L发酵罐时，各操作参数进行规模缩小时所采取策略。 第89页07:4490完成操作参数规模缩小，建立了整个培养过程“规模缩小模型”后，就需要对此模型进行验证，以判定该模型与其所代表商业培养规模是否含有等效性。验证方法是比较两过程性能参数是否一致。据此来判定，建立“规模缩小模型”是否成功。细胞培养过程性能指标常被用来当做判定依据。细胞培养条件研究DOE第90页07:4491细胞培养条件研究DOE细胞生长情况能够经过比较生长曲线，或者直接比较细胞比生长速率，来考查不一样培养规模下细胞生长情况。这部分工作也能够经过测定培养液光密度、固形物体积，细胞干重、细胞湿重等方法进行。模拟效果好“规模缩小模型”能够与大规模培养过程含有相同细胞比生长速率和细胞