蛋白电泳异常分析

1、H松巨盹臼了 1幷干是为I魁怪合话前舟恥啟虐，E垛凰【话的盘格自I SD5-FAGE &TWSIU 下层肢h不同遥盧的d$_pge狩窗胺的昙桂好曲范因=5口占GE分蛋底般度50 150KD嚥底30-QtOkD20-BOO讹腹T2-60k315%薮注！如舷制菲匪性險 彗都肉菽宵彷，刃蔑肢申不加10%SDSPr可配融用冼怪FAftFfo.SDS勒胶的有效分离范阖丙烯联胺浓度L512.5107.55,01乩上业ThZOkDaLfi-lcDa30-J20kDa60-212 kDa1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS- PAG环连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离

2、胶； 而电泳缓冲液使用的 Tris -甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比， 这一区带便形成 了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。 当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后， 同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解 决

3、问题的情况，应首要考虑该因素。2样品如何处理？工根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和 DTT （或 Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一 般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min,再离心加样。2）带有烷基化作用的还原 SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT,而防止银染时的纹

4、理现象。100ul 样品缓冲液中10ul 20 %的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3） 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1 %SDS沸水中煮3min,未 加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择，分离胶选择，选择tris HCL系统，TEMED与 AP AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS :阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋

5、白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、 去多肽折叠。提高SDS电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合， 可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编着的蛋白质电泳技术手册P82-103。5“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。“皱眉（两边向下中

6、间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液， 加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长， 重新配制；降低凝胶浓度。为什么带出现纹理现象？ _ 主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失

7、去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 2我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH值的Buffer ;降低分离胶的浓度。为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当

8、增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（）；适当降低电压；为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。 比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽 没有正确装配，电流未形成通路。包括： a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝 缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中， 一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED APS剂量不够或者失效。APS应该 现配现用，T