实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性

实验利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性第1页/共18页现代微生物学实验技术第2页/共18页实验内容♣

染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣转座子随机突变及目的表型的筛选♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导♣利用SDS分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取第3页/共18页利用SDS分析融合蛋白的可溶性牛伯庆王子元第4页/共18页实验目的了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白的原理；掌握SDS的原理、实验操作过程及重要性。第5页/共18页基因的基本结构ORF：OpeningReadingFrame启动子终止子转录区

基因RNA起始点ATGTGA核糖体结合位点实验原理第6页/共18页影响基因表达的因素：启动子：控制基因表达的第一步，是高表达的关键；结构基因：密码子偏好性；表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。实验原理第7页/共18页目的基因：受噬菌体T7强转录、翻译及终止信号控制；Lac操纵子；T7RNA聚合酶启动；IPTG诱导；有His-tag标签；大肠杆菌BL21，实验原理第8页/共18页第9页/共18页操纵基因结构基因调节基因启动子阻遏物ß-半乳糖苷酶透性酶乙酰基转移酶乳糖操纵子第10页/共18页切接转增筛表达第11页/共18页实验材料菌株

pET28a-54/BL21(DE3)，pET28a-cho/BL21(DE3)，pET28a/BL21(DE3)2.培养基及试剂(1).培养基：

LB液体培养基(2).电泳溶液凝胶贮存液：

丙烯酰胺29g；甲叉丙烯酰胺1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4℃存放。B.8×浓缩胶缓冲液：1mol/LTris-HCl,pH6.8,4℃存放。第12页/共18页C.4×分离胶缓冲液：1.5mol/LTis-HCl,pH8.8,4℃存放。D.Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris3.03g,甘氨酸14.4g，SDS1.0g，pH8.3，4℃存放。E.上样缓冲液：50mmol/LTris-HCl(pH6.8),100mmol/L巯基乙醇，2%(m/v)SDS,0.1%溴酚蓝，10%(v/v)甘油。F.10%SDSG.10%过硫酸铵H.TEMED(N,N,N´,N´-四甲基乙二胺3.仪器设备

垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等第13页/共18页实验步骤1.菌种的活化及酶的诱导表达菌种活化：分别挑pET28a-54/BL21(DE3)、pET28a-cho/BL21(DE3)、pET28a/BL21(DE3)单菌落于5mlLB+Km液体培养基37℃培养18h。酶的诱导表达：1%的接种量转接于20mlLB+Km液体培养基37℃培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30℃摇床振荡培养2-6h，以空载体为对照。第14页/共18页2.融合蛋白的可溶性分析：(1).12000rpm离心收集菌体，溶于无菌水中；(2).超声破碎菌体：功率200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清；(3).12000rpm离心5min收集上清；(4).将沉淀悬于无菌水中；(5).分别取上清、沉淀做样品处理及SDS分析。3.样品处理：

向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。第15页/共18页4.电泳制胶点样电泳染(脱)色表分离胶与浓缩胶的配制12%分离胶5%浓缩胶水40%凝胶储液(ml)分离胶缓冲液(ml)浓缩胶缓冲液(ml)10%SDS(ml)10%过硫酸铵(ml)TEMED(ml)总体积(ml)6.394

4.53.8—0.150.150.006153.640.625—0.630.050.050.0055注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED

第16页/共18页制胶：

事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。点样：

小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序电泳：

稳压，浓缩胶电压60