抗药性突变株的分离

抗药性突变株的分离第1页，共14页，2023年，2月20日，星期五

学习用梯度平板法分离抗药性突变株一、目的要求第2页，共14页，2023年，2月20日，星期五二、基本原理基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中戚下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。第3页，共14页，2023年，2月20日，星期五在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性空变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以等到所需要的抗药性菌株。抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是十分必要的。第4页，共14页，2023年，2月20日，星期五1)基因突变：是微生物DNA分子的某一特定位置的特定结构改变所致，导致细菌发生不同的生理、生化变化,与药物的存在无关。微生物产生抗药性的原因第5页，共14页，2023年，2月20日，星期五

2)耐药性基因转移:

耐药质粒,转座子,NDM-1(金属

β-内酰胺酶):对β-内酰胺类抗生素（青霉素类抗生素和头孢菌素）、大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、阿奇霉素等）、氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、链霉素等）、四环素类抗生素（四环素、强力霉素、金霉素等，替加环素除外）、喹诺酮类抗菌药（环丙沙星、司帕沙星等）、磺胺类药、利福平等这些常用抗生素有极强的耐药性.第6页，共14页，2023年，2月20日，星期五抗生素诱导的微生物抗药性产生获得性耐药性

：

是指以前敏感细菌，接触抗生素后,由于遗传基因的变化、生存代谢途径的改变而产生的耐药性。为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变菌株常用梯度平板法。第7页，共14页，2023年，2月20日，星期五

不含药物含药物抗药菌株梯度平板法筛选抗药菌株本实验拟用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板，如右图：第8页，共14页，2023年，2月20日，星期五三、器材1.菌株

大肠杆菌：Strs2.培养基

LB液体培养基,10mlLB琼脂培养基，试管2支3.溶液或试剂

链霉素4.仪器或其他用具

1ml无菌吸管，盛有70﹪乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等。第9页，共14页，2023年，2月20日，星期五四、操作步骤1．菌种培养（第一次培养）

接种大肠杆菌于盛有5mLLB液的试管中，37℃震荡培养24h。

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2.梯度平板制作（1）在热水中溶化LB琼脂培养基。（2）倒10mL已溶化的不含药物的LB于无菌平板，并将平板一端垫起，使培养基在倾斜的位置凝固。不含药物的LB琼脂培养基第11页，共14页，2023年，2月20日，星期五（3）在已凝固的平板底部高琼脂的一边标上“低”，水平放置，倒入100μg/mL链霉素（在培养基温度下降至50℃左右加入）的LB琼脂10ml。过夜，以便于抗生素渗透，获得0μg/mL至100μg/mL链霉素梯度平板。含有链霉素的LB琼脂培养基不含药物的LB琼脂培养基第12页，共14页，2023年，2月20日，星期五3.涂布和培养（第二次培养）

用1mL无菌吸管吸取0.2mL大肠杆菌培养液Strs涂布于梯度平板上。用无菌玻璃棒将菌液涂布到整个平板表面。平板倒置于37℃培养48h。第13页，共14页，2023年，2月20日，星期五4.抗性突变菌株分离(第三次培养)

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