吸光光度法3课件

17/23/20237:46PM第6章吸光光度法6.1

吸光光度法基本原理6.2

显色反应及其条件的选择6.3

比色分析方法和仪器6.4

分光光度法的应用返回1一二请在这里输入您的主要叙述内容整体概述三请在这里输入您的主要叙述内容请在这里输入您的主要叙述内容2

37/23/20237:46PM6.1吸光光度法基本原理

一.

概述

二.

光的基本性质

三.

物质的颜色和对光的选择性吸收

四.

光吸收的基本定律

五.

吸光度的加和性

六.

偏离朗伯-比耳定律的原因返回3

47/23/20237:46PM1.定义：基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。它包括比色法、可见分光光度法及紫外分光光度法。

一.概述2.特点：(1)灵敏度高：10-5~10-6mol/L(2)准确度高：比色分析，相对误差5~10%,分光光度法，2~5%，1~2%(3)应用广泛：测多数无机物和许多有机物(4)操作简便仪器设备易普及返回4

57/23/20237:46PM

二.光的基本性质光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。λ=cνE=hν=hcλh为普朗克常数(6.626×10-34J·s)c为光速(3×1010cm/s)德布罗意关系式返回5

67/23/20237:46PM射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光(400~750nm)电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。γ射线→

x射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波续前返回6

77/23/20237:46PM单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿续前返回7

87/23/20237:46PM

三.物质的颜色和对光的选择性吸收完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光返回8

97/23/20237:46PM⑷分子吸收光谱产生：分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级跃迁，从基态跃迁到激发态ΔE=E1－E0=hν=hc/λ

原子吸收光谱：原子外层电子选择性吸⑴吸收光谱

收某些波长电磁波，线光谱

分子吸收光谱：带光谱续前吸收光谱的产生：⑵分子振动能级：分子内部价电子运动，分子内原子振动和分子绕其重心的转动。⑶分子能量：E=Ee+Ev+Er

电子跃迁能级较大，能量在1~20eV,紫外可见吸收光谱在200~780nm返回9

107/23/20237:46PM纯电子能态

间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子内电子跃迁带状光谱锐线光谱A吸收光谱续前返回10

117/23/20237:46PM物质对光的选择吸收:物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择性吸收。

例：A物质B物质同理，得：1

ev=1.610-19J续前返回11

127/23/20237:46PM测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长()为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用途①进行定性分析②进行定量分析③选择吸收波长④判断干扰情况吸收曲线:KMnO4溶液的光吸收曲线续前λmax=525nm返回12

137/23/20237:46PM

四.光吸收的基本定律透光率(透射比)透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It吸光度定义：返回13

147/23/20237:46PM朗伯-比耳定律1760年朗伯提出：c

一定，一束平行的单色光通过一均匀溶液后，溶液对光的吸收程度A与液层的厚度b成正比。A=kb

1852年比耳提出：b一定，A和吸光物质的浓度c成正比。续前A=k'c

返回14

157/23/20237:46PM合并上述两个定律为朗伯-比尔定律K是k

和k'合并常数T：透光率A：吸光度T=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%1.00.50AcA100500T%T续前返回15吸光系数b

：吸光液层的厚度，光程，cmc：吸光物质的浓度，g/L,mol/LK：比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位有关c：mol/LK

摩尔吸光系数L·mol–1·cm-1c：g/LK

a吸光系数L·g–1·cm-1c：g/100mLK

比吸光系数相互关系

167/23/20237:46PM续前返回16

177/23/20237:46PMε的含义(1)ε是吸光物质在一定波长和物质中的特征常数，反映该吸光物质的灵敏度。ε值越大，表示该吸光物质对此波长光的吸收能力越强，显色反应越灵敏，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以εmax表示；(2)桑德尔（Sandell）灵敏度S

仪器检测限为A=0.001时，单位截面积(cm2)光程内所含吸光物质的最低含量，其单位是

μg·cm-2,S与ε的关系：S=M/ε续前返回17

187/23/20237:46PM需知公式:

A=abc

ε=MaS=M/ε例:铁（Ⅱ）浓度为5.0×10-4g·L-1的溶液，与邻二氮菲反应，生成橙红色配合物。该配合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.190。计算邻二氮菲铁的a、ε及S。S=M/ε=55.85/(1.1×104)=5.0×10-4μg·cm-2续前解：先求a，再求ε。已知M

(Fe)=55.85

a=A/bc=0.190/(2×5.0×10-4)=190L·g-1·cm-1ε=Ma=55.85×190=1.1×104L·mol-1·cm-1返回18

197/23/20237:46PM

五.吸光度的加和性吸收定律与吸收光谱的关系AC吸收定律A吸收光谱多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即续前返回19

207/23/20237:46PM

六.偏离朗伯-比耳定律的原因1.非单色光引起的偏离

严格讲比耳定律只适用于单色光。选单色光纯度高仪器,用最大吸收波长、或适当低的浓度测定可避免AC2.介质不均匀引起的偏离：胶体、乳浊液或悬浮物质吸收、散射3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离：物质的解离、缔合、形成化合物或互异构续前返回20

217/23/20237:46PM6.2显色反应及其条件的选择

6.2.1显色反应

6.2.2显色条件的选择

6.2.3

光度测量条件的选择返回21

227/23/20237:46PM

6.2.1显色反应显色反应：将待测组分转变为有色化合物的反应显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂

M+R=MR(被测组分)(显色剂)(有色化合物)无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。如Fe2+的测定：返回22

237/23/20237:46PM有机物质官能团强吸收直接测定官能团弱吸收衍生化反应显色反应332+桔红色max邻二氮菲续前返回23

247/23/20237:46PM显色剂无机显色剂:应用不多，因其生成配位化合物不稳定，灵敏度及选择性不高。有机显色剂:大多能与金属离子生成极其稳定的螯合物，具有特征颜色，其选择性、灵敏度均高。不少螯合物易溶于有机溶剂，可以进行萃取比色。有机显色剂多是含有生色团和助色团的化合物。续前返回24

257/23/20237:46PM生色团含有不饱和键的基团，如-N=N-,＞C=C＜,

-N=O,＞C=O,＞C=S、醌基等。助色团某些含有孤对电子的基团,它们与生色团上的不饱和键相互作用,影响其吸收,使颜色加深（红移）。如-OH,-RH,-NH2,-NHR,

-SH,-Cl,-Br,-I等。续前返回25

267/23/20237:46PM⑴灵敏度高:ε＞105超高灵敏，ε=(6~10)×104高灵敏,ε=(2~6)×104中等，ε＜2×104不灵敏⑵显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。Δλ=|λmaxMR-λmaxR|≥60nm⑶有色化合物组成及化学性质稳定以及选择性好干扰小续前显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应对显色反应的要求：返回26

277/23/20237:46PM

6.2.2显色条件的选择1.显色剂的用量：保证反应完全,适当过量实际工作中，作A

~cR曲线，寻找适宜cR

范围。ACR2.溶液的酸度：OH-M+nR=MRnH+⑴影响显色剂浓度和颜色⑵影响Mn+的存在状态⑶影响配合物的组成返回27

287/23/20237:46PM实际工作中，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。ApH3.显色时间：实际工作中，作A~t曲线，寻找适宜反应时间。4.显色温度：实际工作中，作A~T曲线，寻找适宜反应温度ATAT续前返回28

297/23/20237:46PM5.溶剂的影响：6.干扰及其削除：降低有色化合物的离解度，增加灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入与水混溶的有机试剂（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解离度而使颜色加深，提高了测定灵敏度。（1）控制溶液酸度；（2）加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂；（3）利用氧化还原反应改变离子的状态；续前返回29

307/23/20237:46PM（4）选择适当的波长，要求吸收大，干扰小；（5）选择合适的参比溶液；（6）采用适当的预先分离的方法。

6.2.3光度测量条件的选择1.测量波长的选择：原则：“吸收最大，干扰最小”，ε大，A变化小的区域。续前返回30

317/23/20237:46PM无干扰，选择max有干扰AA1.非单色光影响小2.灵敏度高控制A=0.15~1T=70%~10%

方法选择c选择

b2.吸光度范围的选择：续前返回31

327/23/20237:46PM(2)÷(1)

以有限值表示：

A=-lgT=-0.434lnT=εbc

(1)

将上式微分：

(2)一般光度计ΔT约为±0.2%~±2%。假定为±1%，代入上式计算不同浓度相对误差如下表和下图。续前返回32

337/23/20237:46PM表6.5不同T(或A)时的浓度测量的相对误差透光率T/%吸光度A相对误差

Δc/c/%透光率T/%吸光度A相对误差

Δc/c/%950.022(±)20.5200.6993.11900.04510.6101.0004.34800.0975.59700.1554.00600.2223.26500.3012.88400.3982.7336.80.4342.72300.5232.770.368续前返回33

347/23/20237:46PM3.参比溶液的选择：作用：扣除非待测组分的吸收，调A=0或T=100%以显色反应为例进行讨论M+R=M-R

max试液显色剂吸收池吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测

M-R

的吸收maxA(样)=A(待测吸光物质)+

A(干扰)+A(池)A(参比)=

A(干扰)+A(池)续前返回34

357/23/20237:46PM6.3比色分析方法和仪器

6.3.1

目视比色法

6.3.2

分光光度法

6.3.3

光度分析仪器返回35

367/23/20237:46PM

标准曲线的制作3.标准曲线不通过原点原因：参比选择不当；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清洁等1.制作依据：吸收定律

A=εbc

吸光度与吸光物质的含量呈正比关系2.制作方法：在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列(不少于5)不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（或工作曲线）。然后再测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。(标准曲线制作视频)续前返回36

377/23/20237:46PM续前返回A010302050400.10.20.40.3Fe2+(μg/50mL)37

387/23/20237:46PM6.3.1目视比色法目视比色法：用眼睛观察，比较溶液颜色深度。标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高返回38

397/23/20237:46PM6.3.2分光光度法分光光度法：使用分光光度计进行测定的方法与比色法比较：（1）是用仪器代替人眼进行测量，消除了人的主观误差，提高了准确度；（2）待测溶液中有其它有色物质共存时，可以选择适当的单色光和参比溶液来消除干扰，因而提高选择性；（3）在分析大批试样时，使用标准曲线法可以简化手续，加快分析速度。返回39

407/23/20237:46PM分光光度法标准曲线法※一元线性回归法※标准对照法内插法通过下面一个例题说明这4种方法续前返回40

417/23/20237:46PM

例2

用邻二氮菲分光光度法测定铁的标准曲线，数据如下表：

cFe2+/(μg/50mL)A10203040500.0500.1200.1800.2400.310

40.00mL水样在相同条件下测定的吸光度为0.160，求水样中铁的含量。

标准曲线法首先绘制标准曲线，然后查找试液吸光度对应的浓度为

cFe2+=27.0(μg/50mL)，再换算水样铁的含量:返回41

427/23/20237:46PM续前返回A010302050400.10.20.40.3Fe2+(μg/50mL)42

437/23/20237:46PM

回归分析法

A与c之间的关系可用一元线性回归方程表示：

A=a+bc

式中b为直线的斜率，计算式：a为直线的截距，计算式：

A与c之间的线性关系用相关系数r

来衡量，|r|→1，线性关系越好，一般分光光度分析法|r|>0.999，计算式：返回43

447/23/20237:46PM

采用回归分析法得到：

b

=0.0064,a=-0.012,r=0.9993回归方程为：A=-0.012+0.0064cFe2+(μg/50mL)将水样吸光度0.160代入得：b值的简易计算:用两点A值比上对应两点c值,如：续前返回44

457/23/20237:46PM

水样中铁的含量：

由直线的斜率可求ε：文献值：1.1×104标准对照法：A标=εbc标A测=εbc测续前返回45

467/23/20237:46PM

本例：内插法：

c:

20

x

30

A:

0.120

0.160

0.180续前返回46

477/23/20237:46PM6.3.3光度分析仪器光度分析仪器：主要部件：光源、单色器、吸收池、检测器、读数指示器0.575光源单色器吸收池检测器显示续前返回47

487/23/20237:46PM紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯,氘灯,185~350nm；卤钨灯，250~2000nm基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光棱镜:光栅:玻璃,350~2500nm,石英,185~4500nm平面透射光栅，反射光栅光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示续前返回48单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示

497/23/20237:46PM续前返回49

507/23/20237:46PM单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器续前返回50

517/23/20237:46PM6.4分光光度法的应用

6.4.1单组分的测定

6.4.2多组分的测定

6.4.3示差分光光度法返回51

527/23/20237:46PM6.4.1单组分的测定

一.水中铁的测定原理：在pH3~9的溶液中，

Fe2++3C12H8N2→［Fe(C12H8N2)3］2+邻二氮菲橙红色λmax=510nm

ε=1.1×104L·mol-1·cm-1二.水中Cr6+的测定原理：在酸性(c1/2H2SO4=0.2mol/L)条件下