加工过程对脂肪氧合酶活力的影响

加工过程对脂肪氧合酶活力的影响

传统的生产工艺具有很长的生产过程和很长的生产过程。在这个过程中,脂类物质发生了水解氧化。众多研究表明,干腌火腿大量的风味成分是由脂肪氧化产生[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10]。其中高于5个碳原子的直链醇、醛、酮、烷基呋喃等成分是典型的脂肪氧化产物;通过氧化还能生成酸类物质、内酯等风味成分。另外,由脂肪氧化生成的一级产物还可以进一步发生反应,如参与美拉德反应等,形成大量的二级风味产物。金华火腿风味物质中约有50%的风味成分直接来自于脂肪氧化。干腌火腿生产过程中,适量氧化可产生满意的风味特点,过度氧化则会给产品带来不愉快的风味,因此脂肪氧化在火腿风味形成和品质控制中具有十分重要的作用。多位学者对西方著名干腌火腿生产过程中脂肪的氧化情况进行了研究。结果显示,在干腌火腿生产过程中,脂肪氧化受多种因素影响,如原料的特点和化学组成、生产条件和生产使用的添加剂、辅料的品种和用量。脂类物质的氧化十分复杂,分为自动氧化和酶氧化两种情况,但不管何种氧化都属自由基氧化。自动氧化是在光和金属离子作用下发生的氧化,酶氧化则是在脂肪氧合酶(EC1.13.11.12,lipoxygenase,LOX)作用下产生的氧化。脂肪氧合酶是一种含非血红素铁的蛋白质,大多数的脂肪氧合酶以花生四烯酸为主要底物,猪骨骼肌中的脂肪氧合酶还能以亚油酸为底物。该酶主要作用是从不饱和脂肪酸中的1,4-戊二烯结构中有立体取向地消除氢,随后发生氧合作用。另外脂肪氧合酶还能够断裂氢过氧基邻位上的C-C键,形成风味物质醛和烷、烯烃。一些研究通过利用脂肪氧合酶抑制剂证实了脂肪氧合酶与动物风味成分中的短链羰基化合物的形成相关。姜颖等研究了去势公兔中的主要腥味成分已醛与脂肪氧合酶的关系。Gata等研究了Iberian火腿原料Iberian猪腿股二头肌中的脂肪氧合酶特性,认为Iberian猪股二头肌中的脂肪氧合酶主要以亚油酸为底物,其活力是以花四烯酸为底物时的20~30倍,火腿风味的产生与脂肪氧合酶有关。但有关火腿生产过程中脂肪氧合酶变化情况的报道较少,也未见中式干腌火腿生产过程中脂肪氧化情况的系统报道。本实验跟踪研究金华火腿生产过程中的脂质氧化和脂肪氧合酶的活力变化,并利用响应曲面法对脂肪氧合酶的加工特性进行研究,以期为科学认识干腌火腿风味形成机理,优化生产工艺及参数,进而达到控制风味形成,实现金华火腿的工业化、标准化生产提供理论支持。1材料和方法1.1生产工艺和温湿度60条单个两头乌杂交猪(5~6月龄,90~100kg)后腿,重6.2~6.9kg,按传统工艺过程加工,每天早、中、晚三次记录生产车间温、湿度的变化。简要生产工艺过程为:原料→修坯→摊凉→腌制→洗腿→晒腿→发酵成熟→后熟→成品分别于主要工艺段随机取5只腿的股二头肌为样品,样品取出后真空封口,立即于-25℃下冻藏,取样工艺点和生产天数及温湿度记录如表1所示。TEPSigma公司;HI92240pH计HANNA公司。1.2方法1.2.1硝酸盐含量测定氯化钠含量测定:按ISO1841-1:1996方法进行;硝酸盐含量测定:按ISO3091-1975方法进行;亚硝酸盐含量测定:按ISO2918-1975方法进行;肌肉pH值测定:按ISO2917:1999方法用pH计进行。1.2.2样品的制备取少许样品于4℃解冻,剔除股二头肌中可见结缔组织和脂肪,将样品剪成2mm大小的碎肉,精确称取一定量处理好的样品,按Folch等的方法,用2:1的氯仿:甲醇溶液提取。提取液用旋转蒸发仪在真空条件下干燥,干燥完毕后充氮气于低温存放。1.2.3硫代巴比妥酸值tep采用Gambotti的方法。共轭二烯值与羰基值测定时取250μg抽提脂肪,用2ml环已烷溶解,分别测定232、215、275nm处的吸光度,以232/215表示共轭二烯值,以275/215表示羰基值。硫代巴比妥酸值测定时取5g肌肉样品与16ml3.86%的高氯酸混合,均浆、定容、过滤,取2ml滤液与2ml0.02mol/LTBA溶液混合,在暗处避光放置17h,之后在532nm下测吸光度。用TEP(1,1,3,3-tetraethoxypropane)作标准曲线。结果以μgTEP/g肌肉表示。1.2.4氨基酸钠底物添加量的筛选粗酶液的提取:按Gata的方法进行。一定量研碎的样品与3倍的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)于冰水浴中混合,匀浆4次,每次10s。缓冲液中含有1mmol/L的β-巯基乙醇,0.5mmol/L的苯磺酸氟化物(PMFS)和2mmol/L的EDTA。之后于冰水浴中匀浆30min,用四层纱布过滤,然后于10000×g下离心15min,离心液经过滤再于100000×g离心1h,上清液用于酶活力的测定并用双缩脲法测定蛋白质含量。底物溶液准备:140mg亚油酸溶于5ml含有180μl的吐温20(Tween20)脱氧重蒸水中,该溶液用2N的NaOH调节pH为9.0,直到亚油酸完全溶解并且pH保持稳定。然后用脱氧重蒸水定容到50ml。该底物溶液于氮气环境中在低温下贮存。活力测定:200μl亚油酸钠底物与2.9ml50mmol/L,pH为5.5的柠檬酸缓冲溶液混合,于20℃水浴中保温并使其快速恒温,待其在234nm处的吸光度稳定后,加入0.1ml酶液,迅速混合均匀于20℃、234nm处测其1min内吸光度的增加量。1个酶活力单位表示为每分钟每克蛋白质吸光度增加1。1.2.5酶液的提取和测定用Design-Expert6.0软件进行试验设计,共计29组试验,以鲜腿股二头肌作样品按1.2.4方法提取酶液。酶活测定时用浓度为50mmol/L、pH为5.8的柠檬酸缓冲溶液。其余条件同1.2.4。响应曲面试验酶活测定缓冲液在使用前按表2所示调整盐、硝酸盐和亚硝酸盐的含量,测定酶活时保温温度按表2试验设计要求。2结果与分析2.1不同工艺步骤原料阶段tba值的变化表3所示为生产过程中脂肪的氧化及相关指标的变化情况。结果显示,脂肪的氧化从盐后工艺步骤开始。根据统计结果TBA值可以分为三个显著水平,原料腿最低,晒后最高,其它工艺步骤无显著区别(p>0.05)。羰基值和共轭二烯值变化十分一致,从统计结果上分析,这两个指标的数值都可以分成两个水平,盐后最高,该值与其它工艺步骤的结果具有显著差异(p<0.05),其它工艺步骤无显著差异(p>0.05)。2.2盐和硝酸盐含量对脂肪氧合酶活力的影响表4所示为生产过程中脂肪氧合酶活力的变化情况。结果显示,脂肪氧合酶的活力在盐后显著提高,多达57%,之后酶的活力逐步下降。到成熟结束后,酶活力变化趋稳定,最后的三个工艺步骤酶活力变化不显著(p>0.05)。但直到后熟-2,仍有较高的酶活表现率,为0.61。脂肪氧合酶响应曲面二次回归模型方差分析结果见表5。由结果可知,温度(因素B)、盐含量(因素C)和硝酸盐含量(因素D)是脂肪氧合酶活力的显著影响因子(p<0.05),亚硝酸盐在实验水平范围内对酶活力无显著影响(p>0.05)。温度与硝酸盐含量及温度与盐含量之间的交互作用均对酶活产生显著的影响(p<0.01)。回归分析发现,二次回归模型显著(p<0.0001)。回归诊断结果表明,回归方程效果良好,虽然拟合度R2相对较低,但信噪比12.3远大于临界值4,表明回归方程式有效。回归方程如下式所示。式中,B、C、D分别为温度、盐含量和硝酸盐含量;Ln(ox)为脂肪氧合酶活力自然对数值。温度和盐含量对脂肪氧合酶活力影响的响应曲面图如图1所示。温度对酶活力的影响比较复杂,总体而言,温度低时表现出对酶活的促进作用,高于一定的温度临界值后,又表现为对酶活的抑制作用。该温度临界值与盐含量有关,当盐含量较低时,该值较高。在盐含量为0时,至25℃左右时,酶活力趋于稳定,后期的增加趋势不显著;当盐含量为5%时,至23~25℃酶活力达到最高值,之后下降;当盐含量为10%时,酶活力在18~20℃达到最高值,低于此值,酶活随温度的增大而增高,高于此值,酶活随温度的增高而下降。盐含量对酶活的影响则表现为约29℃之前,酶活力随盐含量增大而增大,约29℃之后,酶活力则随盐含量的升高而下降。温度和硝酸盐含量对脂肪氧合酶活力的影响如图2所示。温度低时表现出对酶活的促进作用,高于一定的温度临界值后,又表现为对酶活的抑制作用。总体而言,硝酸盐表现出对酶活的抑制作用,与酶活呈负相关。但当温度高于37℃,随硝酸盐含量的提高酶活出现增大趋势;在温度低于37℃时,酶活几乎随硝酸盐含量呈直线下降。3讨论3.1实验结果的分析在所测的氧化指标中,TBA值所反应的是脂肪氧化的最终产物丙二醛的含量,但在肌肉组织中,丙二醛作为一种具有双官能团的化合物还可以与蛋白质、酶的胺基和DNA发生作用,因此不能完全表示氧化的累计值;羰基值作为衡量脂肪氧化的指标,主要反应了醛、酮、酸羰基化合物的含量。共轭二烯值反应了不饱和双键受到自由基进攻时形成共轭二烯的情况,其形成伴随着氢过氧化物的产生。该产物存在时间短,很快发生分解而形成氧化产物,故该值反应了特定时间下的氧化情况。综合分析三个指标的变化,可以认为氧化现象的大量发生从腌制工艺开始。该实验结果与Andres的研究结果具有一定可比性。在Andres的结果中,Iberian火腿生产过程中TBA值在原料、盐后(102d)、盐制结束(138d)均无显著区别(p>0.05)。但在干燥后(173d),TBA值有了显著增加,然后又回落到与先前工艺步骤无显著区别的水平。结合本实验结果同时考虑Andres和Gambotti的实验结果,可以认为,干腌火腿生产过程中脂肪氧化的发生与生产时间没有很大的必然联系,而主要与生产工艺相关。Andres和Gambotti的结果中氧化最大值出现在生产的第6个月,从工艺步骤上看是晾晒阶段,与本实验结果中氧化的大量发生出现在盐后和晾晒步骤相似。而在该工艺步骤原料腿发生的主要变化是盐含量和环境温度的提高以及日照的发生。因此可以认为盐含量、温度和日照是影响氧化情况的主要因素。3.2生产过程中酶的实际活力有关脂肪氧合酶在火腿加工过程中的变化报道较少。Gata等研究了Iberian猪腿股二头肌中脂肪氧合酶的情况,经初步纯化的酶活为53U/min·g蛋白,该酶分子量约为90kD,主要以亚油酸为底物,最适pH值为5.5,脂肪氧合酶参与了Iberian火腿的风味形成。姜颖等人研究去势公免腥味物质时用免的腹部肌肉为样品,酶的活力约为0.973U/min·g蛋白,但未交待反应温度。以上研究结果均说明了脂肪氧合酶在脂肪氧化形成风味成分中的作用,但所得酶活结果有较大差异。测酶活时所用方法与本实验相同,因此该差异可能与原料品种和取样部位不同有关。酶活测定是在酶的最适条件下进行的,因此所测活力实际上是酶的潜在活力,而不是生产加工过程中酶所表现的实际活力。从表4所示的生产过程中酶的潜在活力变化情况看,酶活在盐后达到最高,之后不断下降。该原因与脂肪氧合酶的特点有关。脂肪氧合酶中含有铁离子,当铁离子以Fe2+的形式存在时,酶处于非激活状态;当铁离子以Fe3+形式存在时,酶处于激活状态,表现出酶活。脂肪氧合酶中的铁离子由Fe2+到Fe3+的转变是在脂肪酸的氢过氧化物作用下产生的,因此脂肪氧合酶的作用表现出一定的滞后性。原料中脂肪氧合酶中的Fe2+尚未转化为Fe3+,或仅有少量转化为Fe3+,因此酶处于非激活状态或仅有少量酶被激活,表现出较低的活力。根据氧化指标的变化情况,盐后的共扼二烯值、羰基值和硫代巴比妥酸值都显著提高,此时酶被激活,这是盐后酶活力显著提高的原因。随着生产过程的进行,细胞组织中的蛋白酶释放;另外由于盐含量的提高带来了盐的浓缩效应从而使脂肪氧合酶受到了破坏,因此从盐后工艺步骤开始,其活力不断下降。利用所得回归方程对酶活力进行预测,得到的生产过程取样工艺点的实际酶活如表6所示。从该预测结果分析分现,生产过程中脂肪氧合酶的实际表现活力变化完全不同于其潜在活力的变化,潜在活力在盐后达到最高,而实际活力在成熟中期达到最高。在成熟中期之前酶的实际活力均低于其潜在活力,成熟结束和后熟-1的实际活力高于潜在活力,后熟-2的实际酶活和潜在酶活相似。造成以上差异的原因主要是生产过程中温度、盐含量和硝酸盐含量的变化。因为在约29℃之前,盐对酶活表现出促进作用,因此随盐含量的升高,酶活不断上升,而在成熟中期以后,盐含量在9.0%左右,而此时温度在30℃以上,此时的温度表现出对酶活的抑制作用;另外此时酶活表现率较低(表4),因此实际酶活开始下降,至后熟-2,温度低、硝酸盐含量高、酶活表现率低,这是后熟-2实际酶活低的原因。用预测的脂肪氧合酶在生产过程中的实际活力与TBA值、共轭二烯值和羰基值作散点图,并进行相关性分析发现,预测的实际酶活与TBA值、共轭二烯值和羰基值的R2分别为0.09、0.19、0.23,其相关性很低,只能解释脂肪氧化