重组人胰岛素原6-arg-arg-人胰岛素原的发酵及下游纯化工艺的优化

重组人胰岛素原6-arg-arg-人胰岛素原的发酵及下游纯化工艺的优化

目前，ri有三种国际药物重组（ri）的方法。1)用基因工程大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)分别发酵生产人胰岛素(humaninsulin,hI)的A、B链,然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用;2)用基因工程E.coli发酵生产人胰岛素原(humanproinsulin,hPI),后经加工形成hI。E.coli系统表达量高,但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI;3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(1～50mg/L),产量低。因此,虽然rhI投放市场已久,但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略,尤其是对E.coli表达系统的研究更是越来越深入,用E.coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面,在胰岛素的基因工程生产中,下游处理非常复杂,复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量,简化下游处理过程等方面进行探索,建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E.coli发酵表达(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原,后加工成hI的制备工艺。1实验部分1.1病毒RRhPI/pQE-40E.coliM15菌株,按文献的方法构建。1.2其它试剂和仪器DEAE-SepharoseFF(琼脂糖快流速阴离子交换剂)为杭州争光树脂有限公司产品,SephadexG-25为Sigma公司产品,Superdex75为GE公司产品,溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均为Sigma公司产品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和还原型(GSH)为上海博奥生物科技有限公司产品,二硫苏糖醇(DTT)为OrganicsInc.产品,β-巯基乙醇和异丙基-β-D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG)为BBI分装,其它试剂均为国产或进口分析纯。1.3-4-4-4-4重组菌体的制备参照文献,采用二级发酵的方式,用正交法优化培养条件,并将优化条件用于发酵罐进行发酵,收获湿菌体。RRhPI/pQE-40E.coliM15的发酵罐培养:将10ml经过活化的RRhPI/pQE-40E.coliM15转移至100ml培养基中进行培养,培养一段时间后,将其转移至含有1.5L培养基的发酵罐中,培养一段时间(转速为300r/min,通气量为1∶1.5～1∶1.8),过程中加入一定量新鲜的培养基并用NaOH调节pH,之后加入IPTG并升温诱导RRhPI的表达,转速随即调为400～500r/min,增大通气量至1∶1.8～1∶2.0,继续培养一段时间后,收集菌体。1.4上清液和沉淀将收集的湿菌体冻存于-20℃,然后悬浮于缓冲液A(50mmol/LTris-HCl,0.5mmol/LEDTA,50mmol/LNaCl,5%甘油,0.1～0.5mmol/LDTT,pH7.9)(5～6ml/g湿菌)中,加入溶菌酶(5mg/g湿菌体),室温或37℃振荡2h。冰浴超声10s×30次,其间每次间隔20s,功率为200W。10℃条件下1000g离心5min去除细胞碎片。上清液中的包涵体(Inclusionbody,IB)在4℃条件下27000g离心15min收集,然后用含2mol/L尿素的缓冲液A充分悬浮,室温静置30min后4℃条件下17000g离心15min,收集沉淀。沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮,4℃条件下17000g离心15min,收集沉淀。最后沉淀用10mmol/LTris-HCl,pH7.3洗涤两次(4℃,17000g离心15min)。1.5洗脱溶液的制备参照文献,将收集的IB用含有0.1%～0.3%β-巯基乙醇的缓冲液B(30mmol/LTris-HCl,8mol/L尿素,pH8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-SepharoseFF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。1.6gly-naoh重组蛋白的制备将初步纯化后的RRhPI通过SephadexG-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50mmol/LGly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.1～0.6mg/ml,收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分,加入适量GSH和GSSG,4℃放置24h。1.7羧肽酶b的合成向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶B,37℃酶切一段时间,然后用0.1mol/LZnCl2终止反应并沉淀生成的hI。1.8hi的纯度参照文献的方法。2结果与讨论2.1发酵条件筛选采用正交法,结合前期研究结果,选取影响细菌培养和RRhPI表达的主要因素(培养基组成,接种量,种龄,通风量,诱导时间,诱导剂IPTG的量以及补料方式等等),以每升培养基收获湿菌体和IB的量为目标量进行全面优化,优化出最佳发酵条件。实验结果表明,最优化培养基组成为5g/L胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5g/L硫酸铵,2.5g/L葡萄糖,2.7g/L甘油,100mg/L氨苄青霉素,50mg/L卡那霉素,pH7.2。采用最优培养基,在最优培养条件下(在对数生长中期加入0.5mmol/LIPTG诱导4h),用发酵罐进行发酵,通过补料和转速调节,细菌能高效表达RRhPI,实验结果见表1。为了使含有外源基因的E.coli旺盛生长进而高效表达,必须提供充足而合适的营养,首先应选择合适的碳源。由于细菌利用葡萄糖生长迅速,并且测定方便,便于进行发酵过程的监控及发酵策略的制定,因此葡萄糖成为E.coli发酵中最常用的碳源,但是高浓度的葡萄糖会产生代谢副产物乙酸抑制E.coli的生长,从而使葡萄糖的应用受到限制。以甘油为碳源,菌体的生长速度及呼吸强度与用葡萄糖相差不大,且不产生乙酸,因此更易达到重组菌的高密度及外源蛋白的高效表达,但发酵液中的甘油定量检测方法烦琐,且价格较贵,不适于发酵条件的筛选及实际生产中的发酵监测。因此本研究选取葡萄糖和甘油作为复合碳源,既可满足E.coli的生长需要,又可降低葡萄糖的浓度,防止代谢副产物乙酸的堆积,而且可以通过葡萄糖含量的快速测定监测整个发酵过程,制定出合适的方案,为今后的工业化生产做准备。在对数生长期,细胞迅速繁殖,对营养和氧的需求量猛增,营养和氧就成为菌群旺盛代谢的限制因素,这时诱导将有利于外源蛋白的高效表达。本研究选择RRhPI/pQE-40E.coliM15对数生长期的中期进行诱导,同时在高密度发酵后期,适时地提高通气量并补加新鲜的培养基,不但改善了细菌生长的营养状况,而且降低了代谢产物的抑制作用,提高了目的蛋白的表达效率(每升培养基可收获菌体51.2g,IB16.2g)。2.2下游生产2.2.1rr-hpi的复合性将0.6gIB分别用含0.1%,0.2%,0.3%β-巯基乙醇的30mmol/LTris-HCl,8mol/L尿素,pH8.0溶解,进行DEAE-SepharoseFF离子交换层析,然后将收集得到的RRhPI组分通过SephadexG-25脱尿素以使RRhPI复性。不同浓度β-巯基乙醇溶解的样品经过离子交换层析后,在相同的洗脱条件下通过SephadexG-25进行层析,层析图谱见图1。峰1为一些高分子量杂质,RRhPI的二聚体及多聚体以及折叠不正确的RRhPI。峰2为趋于正确折叠的RRhPI单体。由层析图谱可以看出,随着β-巯基乙醇浓度的增大,趋于正确折叠的RRhPI单体量明显增加,在总蛋白中所占比例也明显增大。因此选用0.3%β-巯基乙醇溶解还原样品。2.2.2复性产物的结构表征当E.coli受IPTG和温度影响被诱导产生表达产物RRhPI时,目的基因的过度表达使蛋白没有足够的时间折叠成天然构象,而是以无活性的IB形式存在,而且胰岛素原分子中的三对二硫键也未能正确配对,从而导致蛋白的深度变性(还原变性——相对于二硫键未被破坏的变性)。因此RRhPI的复性不仅要恢复原有的氢键、疏水键,还存在二硫键的重新对接问题。要形成有活性的最终产物hI,胰岛素原分子中的两个链间二硫键和一个链内二硫键必须全部正确对接,复性难度相当大。由于热力学等原因,某些二硫键极不易形成,因此复性产物中除全部正确对接的产物外,还可能存在多种副产物。围绕提高还原变性胰岛素原等蛋白中二硫键的正确对接率这一分子生物学中的前沿课题,人们进行了许多探索:如在复性液中加入二硫键异构酶、分子伴侣等来催化二硫键的正确配对。但这些方法条件苛刻,不易控制,而且价格昂贵。Ruoppplo等人发现复性液中加入GSSG作为氧化剂可将还原变性蛋白中的巯基氧化,形成蛋白-SSG(P-SSG),P-SSG可与还原蛋白(P-SH)进行反应,即P−SSG+P−SH→P−SS−P+GSHΡ-SSG+Ρ-SΗ→Ρ-SS-Ρ+GSΗ,从而完成二硫键的配对。在GSSG的参与下,二硫键正确对接的选择性提高,因而正确折叠率提高。研究分别采用非氧化型洗脱液(50mmol/LGly-NaOH,pH10.6)和氧化型洗脱液(50mmol/LGly-NaOH,pH10.6+GSSG)进行RRhPI的G-25层析,层析图谱见图1和图2。从图2中可以看出,采用加入GSSG的氧化型洗脱液后,色谱峰变为3个,峰2为正确折叠率高的RRhPI单体,峰3为介于正确折叠与不正确折叠的的RRhPI之间的折叠中间体。其峰2组分收集后再加入GSH和GSSG能较容易地形成具有天然构象的RRhPI,从而使随后的酶切效率也较高,因而可有效地提高hI的最终收率。而图1采用非氧化型洗脱液,仅形成两个峰,峰2为正确折叠率较低的RRhPI及折叠中间体的混合峰,总体复性率较低,因此导致hI最终收率也较低。2.2.3最优方案的确定及验证由于复性液pH、GSH与GSSG的比例、酶切时间、胰蛋白酶与羧肽酶的量对复性与酶切转化有很大影响,因此本研究对这些因素进行了全面优化。参照文献,对影响RRhPI复性及酶切转化的上述4个重要因素进行正交优化。试验结果表明,酶切时间是影响hI收率的显著性因子,复性和酶切的最优方案为:复性液pH10.8、GSH/GSSG为2.5mmol·L-1/0.35mmol·L-1、酶切时间60min、胰蛋白酶与羧肽酶的量分别为1/1000和1/2000g酶/g蛋白。以该方案进行3次验证实验,结果见表2。可以看出,优化后复性率及酶切效率均大为提高,hI最终收率可达74mg/L,超过现有文献报道水平(每升发酵液得rhI约20mg)。3gssg-pge的协同作用由RRhPI制备rhI具有表达量高,可以简化下游纯化过程等优点,本研究结合前期研究结果,选取影响细菌培养和RRhPI表达的主要因素进行全面优化,采用甘油和葡萄糖组成的复合碳源,细菌能高效表达RRhPI。在GSSG的参与下,IB复性时二硫键正确对接的选择性提高,因而复性率提高。本研究将GSSG加至SephadexG-