首医大临床生物化学实验课件05 TG、chol的酶法测定 及干扰试验

血清甘油三酯、总胆固醇的酶法测定

（附VitC的干扰试验）

目前几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，虽然方法各异，但一般都包括3个基本步骤：用最合适的LPL水解TG生成甘油和FFA；接着是转化，该步骤一般只用一种酶，例如甘油激酶，将甘油磷酸化以进行下一步反应，或者生成中间待测物；最后是有色染料（常为醌亚胺等）或者紫外吸收物质的形成，再通过分光光度法计算相应的TG浓度。

酶法比化学法具有更多的优越性，适用于自动化仪器，也可手工操作，即可终点法测定，也可作连续检测，所以酶法取代化学法已是必然趋势。

【目的要求】1、掌握酶法测定血清TG的实验原理，了解血清TG测定的临床意义。2、掌握酶法测定血清TC的实验原理，了解血清TC测定的临床意义。3、掌握干扰试验的设计方法，并通过干扰试验加深对此测定方法的理解。【实验原理】

血清中甘油三酯经脂蛋白脂肪酶（LPL）作用，可水解为甘油和脂肪酸，甘油在ATP和甘油激酶（GK）的作用下，生成3—磷酸甘油和ADP，再经磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢。过氧化氢与4—氨基氨替比林及4—氯酚在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与TG的浓度呈正比。原理

TG+3H2OLPLGlycerol+3RCOOHGlycerol+ATPGK+Mg2+G-3-P+ADPG-3-P+O2

GPO

磷酸二羟丙酮+H2O2

2

H2O2+Phenol+4-AminoantipyrinePOD

Chromogen+4H2O干扰试验试验的目的:

用来检测候选方法的恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同干扰:

干扰试验是用于测定某物质加入样品中所产生的系统误差（干扰物浓度一定时产生的是恒定系统误差），用以评价分析方法的准确性。本实验采用VitC作干扰物，观察其对酶法测定血清TG的干扰。

试验的方法:

基本与回收试验一样，但在病人标本中加人的是疑有干扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加人相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质产生的干扰所引起的误差，即干扰值干扰值=干扰标本测得浓度-基础标本测得浓度计算:设计干扰试验应把握的几项原则：（1）可以干扰物的选择：根据分析法的反应原理，参考有关文献，可初步提出哪些物质会产生非特异性反应或干扰作用。一般应考虑的干扰物血红蛋白、胆红素、脂质、防腐剂、抗凝剂和药物等。（2）可疑干扰物的浓度：加入的可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度上限，又可能应达到病理标本的最高值，以便能够确定使分析结果影响临床应用价值的最低可疑物浓度值。（3）干扰物的体积：在试样中应占最小比例（通常应<10%）（4）

吸量要准确。（5）本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作用引起的误差。误差结果分析：干扰实验中，在加入一定浓度干扰物的条件下，形成的是恒定系统误差，即干扰样品测定值与基础样品测定值之差，此差值如〈允许误差（EA）的临界值，表明由干扰物引起的偏差对临床诊断的和治疗不产生不良影响，是可以被接受的。消除干扰常用方法空白对照：试剂空白：常见标本空白：内空白法和外空白法物理、化学方法分离干扰物双波长或多波长法检测排除干扰误差较大又无法消除，则改进或更换方法。【实验操作】临用前将适量的缓冲液（试剂Ⅱ）加入至试剂Ⅰ（酶剂）中配成工作液，稳定10分钟后可使用。1、样品制备基础样品：0.9ml血清+0.1ml蒸馏水干扰样品Ⅰ：0.9ml血清+0.1mlVitC标准液（50mg/dl）干扰样品Ⅱ：0.9ml血清+0.1mlVitC标准液（100mg/dl）准备6支试管按下表操作：加入物(ul)空白管标准管测定管基础样品管干扰样品管Ⅰ干扰样品管Ⅱ蒸馏水20—————TG标准液—20————血清——20———基础样品———20——干扰样品Ⅰ————20—干扰样品Ⅱ—————20酶工作液（ml）2.02.0

2.0

2.0

2.0

2.0

即刻混匀，置37℃保温5分钟，取出，混匀，用分光光度计比色，波长505nm，光径1cm,，空白管调零，读取各管吸光度值。计算1、计算样品TG浓度：TG浓度（mmol/L）=A测/A标×2.26mmol/L2、计算干扰物浓度干扰物浓度（mg/dL

）=VitC标准液浓度×干扰物加入液量/（血清加入液量+干扰物加入液量）3、计算干扰值干扰值（mmol/L）=干扰样品测定值—基础样品测定值血清甘油三酯一般随年龄增加而升高，体重超过标准者往往偏高。

合适范围：≤1.70mmol/L(150mg/dl)，升高：＞1.70mmol/L(150mg/dl)。

【参考值】【注意事项】1、血清TG易受饮食影响，在进食脂肪后血清中TG明显增高，抽血前应禁食12h以上，并要求72h内不饮酒。2、血清中游离甘油对测定结果有一定影响，化学法中因运用了抽提和吸附技术，这种影响较小，全酶法测定中这种影响较大，有人主张常规工作中可讲所得结果减去0.11mmol/L而作粗略校正。3、评价本方法测定血清TG属于一步终点法，操作简单，既可手工操作，也适合自动化分析。但其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离的甘油（FG）。本法线性范围在11.4mmol/L以内，精密度为：批内CV≤3%、批间CV≤5%。加入不同浓度TG，平均回收率98.6%。脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法（GPO-PAP法）等。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，易于达到终点，线性范围宽。用一步法测定的是血清总甘油酯（定义为TG和FG及少量甘油二酯、甘油一酯之和，习惯统称为TG）。为了消除FG的干扰，中华医学会检验分会曾推荐GPO-PAP法的两步酶法作为血清TG常规测定方法。血清FG对TG测定结果的影响一直是临床十分关注的问题。国外资料显示，正常人体血清FG含量为0.06～0.22mmol/L，约占总TG的6%～14%。国内的研究结果与此相近，我国正常人血清FG水平平均约为0.08mmol/L（0.02～0.33mmol/L），约占总TG7.19%（0.81%～21.64%）。虽然临床标本中FG显著升高者很少见，但有些异常或病理情况下如应激反应（肾上腺素激活LPL促进体内脂肪水解），剧烈运动，服用含甘油的药物如硝酸甘油，静脉输入含甘油的营养液，肝素治疗，某些严重的糖尿病、肝病与肾病，取血器材或试管塞上带有甘油等时，可见血清FG显著升高，并给临床决策带来误导。因此，可采取测定“真”TG的方法减少其影响：一种是同时测定总甘油和FG，两个结果的差值反应了真TG浓度（外空白法），另一种是用两步酶法直接测定TG（内空白法）。前者国内外应用较少，后者国外（如日本）使用较多，国内目前已有许多临床实验室开展。

目前国内临床生化检验使用的生化试剂绝大多数都是单一试剂，在甘油三脂测定中测得甘油三脂的含量实际上是标本中甘油三脂与游离甘油的总含量，尽管临床上可以通过减去标本中平均游离甘油的含量和修改正常范围加以弥补，但是，由于临床标本的个体差异，使得血标本中游离甘油的含量不可能都一样。而液体双试剂可先让标本与试剂I反应（试剂I中包括甘油激酶、抗坏血酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶），从而彻底消耗标本中游离甘油，排除抗坏血酸的干扰，然后再用试剂Ⅱ含有LP和发色团启动反应，使得测得的结果真正反映标本中甘油三脂的含量。去除FG干扰可用下列方法：1、外空白法：同时用不含LPL的酶试剂测定FG作空白。2、内空白法：又称两步法或双试剂法—将LPL和4-AAP组成试剂2，其余部分为试剂1。此法目前为中华医学会检验分会推荐方法。【临床意义】血清TG有随年龄而上升的趋势，体重超过标准者甘油三酯往往偏高。病理性增高常见于动脉粥样硬化，家族性脂类代谢紊乱，肾病综合征，糖尿病，甲状腺功能减退，急性胰腺炎，胆道梗阻，原发性甘油三酯增高症。血清TG降低较少见，甲状腺功能亢进，营养不良和消化不良综合征等可引起血清TG的降低。(二)TC的酶法测定特点：

常规测定中现已广泛应用酶法，酶法具有特异性好，精密度和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，既可以手工操作，也适合自动分析，但酶法测定中出现了不同程度的基质效应。

采用酶反应原理的干化学法颇为实用，其缺点是价格高，精密度差。胆固醇的酶测定法始于70年代。由于操作简便，试剂无腐蚀性，特别适用于自动生化分析，目前已成为测定胆固醇的主要方法。【原理】血清中总胆固醇(totalcholesterol，TC)包括游离胆固醇(freecholesterol，FC)和胆固醇酯(cholesterolester，CE)两部分。血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA)，胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢，H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。CEH-COD-PAP法原理：

CE＋H2OFC＋FFAFC＋O2△4-胆甾烯酮＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚醌亚胺＋H2O

胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇从脂蛋白中释放出来【参考范围】血清参考值：3.0～5.20mmol/L；危险阈值：5.20～6.20mmol/L；高胆固醇血症：≥6.20mmol/L。【临床意义】①年龄与性别；②长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高；③遗传因素；④其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。1．TC增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症(如家族性高胆固醇血症、家族性ApoB缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等)、糖尿病、肾病综合征、总胆管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。2．TC降低常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、肝脏疾病、严重感染、营养不良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性黄疸及慢性消耗性疾病，如癌症晚期等。全酶法测Chol始于1974年，在此以前用化学反应测Chol时，除了一些已知的干扰因素外尚未提及基质效应问题。1979年才由Cooper指出Chol酶法中校准液与病人血清的反应性不同，可使Chol测定值偏低5%～7%。

1994年CAP调查570实验室时用了参考方法定值的新鲜冰冻血清为调查材料，15个同方法测定chol组中仍有11个组出现基质偏差，同时用制备物的4个组中，3个有基质偏差。

有的报告指出TG、HDL-C常规方法与CDC的参考方法比较，有明显偏差，甚至>10%。McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存2～26周后，LDL-C测定值平均偏低10%左右。

由于新鲜血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%～+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的。减少基质效应的方法

Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。

改进仪器设计及试剂组成。