二轮复习热点6基因工程中PCR的原理及应用学案

热点6基因工程中PCR的原理及应用

［知识关联］

厂常规PCR

，模板［

一反向PCR

与体内复制的区4£料--^^复制卜

pt分类］-一大引物PCR

【引物J-重叠延伸PCR

-（PCR及其应用

变性一r目的基因的获取和扩增

复上—反应过褂」-目的基因的检测

相关数据的计算］应用一

I」-定点诱变

延伸

［针对训练］

1.（2022•山东威海二模）《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》

对于解除隔离管理标准做了新规定:轻型病例连续两次新型冠状病毒

核酸检测（采样时间至少间隔24小时）N基因和ORF基因Ct值均235,

可解除隔离管理。利用荧光定量PCR方法测某基因的Ct值是指将某

目的基因与过量的灵光素混合后放入PCR反应体系中，随PCR产物的

积累荧光信号逐渐增强，将荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次

数称为Ct值。下列说法错误的是（B）

A.利用荧光定量PCR方法测N基因和ORF基因的Ct值时,应先通过逆

转录得到N基因和0RF基因对应的DNA序列

B.采样标木中的N基因和ORF基因数量越多，Ct值越大

解析:分析题意，将灵光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为

Ct值,故样本中初始模板越多时;达到设定的荧光阈值时所经历的扩

增循环数就越小,Ct值就越低。

2.（2022•全国高三专题练习）如图是快速RT-PCR过程示意图，①和

②为逆转录酶催化的逆转录过程,③是PCR过程。据图分析下列说法

错误的是（B）

--------5,靶RNA

-------3'cDNA

5,RNA

—3%DNA

引物h

3

5cDNA

B.③过程只需要引物b

-PCR可检测基因是否转录

-PCR可检测新型冠状病毒等RNA病毒

解析:③PCR过程需要引物a、bo

3.（2020•江苏卷）如果已知一小段DNA的序歹1J,可采用PCR的方法，

简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以EcoRI酶切为

例）:

染色体DNA

"回崛辍陶

混合的DNA片段

5、系初列|已知序列|未知序尸目片段F

n连接|DNA连接罅

已知序列

PCR引物环状DNA

EcoRI

in扩增|7期DNA聚合酶

，PCR产物

W测序、分析I

5：某片段F

*的完整

序列

请据图回答问题。

（1）步骤I用的EcoRI是一种酶,它通过识别特定

的切割特定位点。

⑵步骤n用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3'-羟基与5'-

磷酸间形成;PCR循环中，升温到95℃是为了获

得;TaqDNA聚合酶的作用是催

化。

⑶若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物步骤HI选用

的PCR引物必须是（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序列（虚线处省略了部分核甘酸序列）

5Z-AACTATGCGCTCATGA--

已知1111111111111111

S'-TTGATACGCGAGTACT-

CCAATGCCTACCCTCT-3'

111111111II11111

序列CGTTACGCATCGGAGA-5,

PCR①5'-AACTATGCGCTCATGA-3z

引物②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3z

⑵磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸

⑶②④

（4）B

热点提升练

一、选择题

1.（2022•全国高三专题练习）Kisspeptir.（Kp）是脊椎动物的一种肽

类激素,对下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH）的神经元有活化作

用。研究者为探究作、GnRH以及GnRH受体的相关基因在下丘脑和垂

体中的表达情况，提取下丘脑和垂体中的RNA,采用RT-PCR扩增

DNA（RT是反转录）进行检测。下列有关叙述不正确的是（D）

-PCR过程需要的酶有逆转录酶、TaqDNA聚合酶

一PCR的产物可采用DNA分子杂交和荧光分子杂交技术

D.可检测到Kp受体、GnRH、GnRH受体相关基因均在下丘脑中表达量

最高

解析:根据题意可知,Kp受体和GnRH基因在下丘脑中表达量会比较高,

但GnRH受体基因应该是在垂体中表达较高，因为垂体分泌细胞才是

GnRH的靶细胞。

2.（2022•北京高三专题练习）研究人员用如图1中质粒和图2中含目

的基因的片段构建重组质粒（图中标注了相关限制酶切割位点），将重

组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是

C)

四环素抗性基因

BamHl引物甲“加dill

IE23-------J

III

t7~——0~~0~->

Bell目的基因引物丙引物乙

图2

A.构建重组质粒的过程应选用BelI和Hindin两种限制酶

杆菌

解析:能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠

杆菌。

3.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列

有关PCR的叙述，错误的是（D）

B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶

C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则

D.延伸过程中，需要4种核糖核甘酸

解析:延伸过程也需要的是4种脱氧核糖核甘酸。

4.控制哺乳动物的性别对于畜牧业生产具有十分重要的意义。SRY基

因是Y染色体上决定雄性性别的基因，SRY—PCR胚胎性别鉴定技术是

现阶段进行胚胎性别鉴定最准确和最有效的方法。下列说法错误的是

(D)

A.可利用Y精子DNA含量比X精子低的差异筛选两种精子，从而对胚

胎性别进行控制

B.从Y染色体DNA分子上获取SRY基因，可用SRY基因的核昔酸序列

设计引物

-PCR胚胎性别鉴定技术中，要用到SRY基因特异性探针进行

检测

D.利用PCR经过3次循环,理论上获得的SRY基因占扩增产物一半

解析：因为经过3次循环之后才能出现目的基因的片段,故利用PCR经

过3次循环,理论上获得的SRY基因占扩增产物的1/4。

5.从自然界中的生物体内分离得到的天然酶,在工业生产环境中催化

效率往往较低。科研人员对醐的改造包括理性设计方法和非理性设计

方法。理性设计方法是通过定点诱变改变蛋白质中的个别氨基酸，以

产生更加理想的酶;非理性设计方法主要通过易错PCR技术实现,该

技术是利用低保真的TaqDNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA

复制的保真度,从而使扩增产物出现较多突变点的一种体外诱导DNA

序列变异的方法。下列相关叙述错误的是(D)

2+

D.易错PCR技术的扩增过程中50℃处理的目的是使DNA分子彻底

变性

解析：通过理性设计，能够产生并得到更加理想的酶的技术称为蛋白

质工程;低保真的TaqDNA聚合酶会增加新DNA链合成过程中碱基的错

配率,会产生较多的突变点;卜房一可以激活DNA聚合酶,故利用易错PCR

技术扩增产物时在PCR反应缓冲液中一般会添加Mg，易错PCR技术

的扩增过程中50℃处理的目的是使引物与模板结合。

6.滁菊为菊科多年生草本植物,长期营养繁殖易造成病毒积累，导致

滁菊花色劣变。某科研小组比较了3种脱毒方法对滁菊体内菊花B病

毒(CVB)和菊花矮化类病毒(CSVd)脱除的效果,结果见表;如图是对不

同试管苗利用CVB基因序列引物进行逆转录PCR(RT_PCR)后的电泳示

意图。下列叙述正确的是(C)

不同脱毒方法对滁菊茎尖脱毒率的影响

脱除脱除

样本脱除CVB

脱毒方法CSVd(CSVd+CVB)

存活数率/%

率/%率/%

茎尖分生

77

组织培养

热处理结

合茎尖71

工口介

病毒噗结

合茎尖1

培养

乂：阳性对照1:阴性对照

A.热处理、病毒哇处理对试管苗的存活率均有显著提高

—PCR中用到的酶有逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶

D.试管苗2、5尚未脱毒成功,3、4已成功脱去CSVd和CVB

解析：由实验结果可知，与对照组相比,热处理、病毒噗处理组的样本

存活数都较少,说明热处理、病毒噗处理对试管苗的存活均有一定的

抑制作用；与对照组相比,热处理结合茎尖培养时，脱除CVB率比较高,

而病毒建结合茎尖组织培养时，脱除CVB率和对照组相差不大，因此

只脱除CVB的最佳选择是热处理结合茎尖组织培养;RT—PCR中包括逆

转录过程和PCR过程,逆转录过程需要用到逆转录酶，而PCR过程需要

用到耐高温的DNA聚合酶；试管苗2、5电泳结果显示阳性结果，试管

苗3、4则没有,说明试管苗3、4成功脱毒(CVB),试管苗2、5未能脱

去CVBo

7.(2022•山东济宁二模)通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的

基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1

序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模

板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制醐a

和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是（D）

酶aT

引物ILL

f引物2

第1轮PCR酶b

,…/①

不引物2

第2轮PCR酶b

悔aT

引物1牛二二三.•二

A酸b

A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3Z端

B.PCR反应体系中需要加入脱氧核甘酸、耐高温的DNA聚合酶、ATP

C.第2轮PCR中，引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因

D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4

解析:DNA的合成方向是从子链的5,端向3'端延伸的，据此可知，图

中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5'

端;PCR反应体系中需要加入脱氧核甘酸、耐高温的DNA聚合酶和缓

冲液等物质，但不需要加入ATP,因为PCR过程中是通过调节温度实现

的，不需消耗能量;第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链不

等长的突变基因，因为图中②是由引物2开始直到完整的DNA单链合

成,而引物1与该模板链的复性过程并没有从该模板DNA单链的一端

开始；在第3轮PCR结束后,会产生2J8（个）DNA分子,其中含突变碱

基对且两条链等长的DNA分子有两个,其他的DNA分子均是不等长的，

因此含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为l/4o

8.在PCR反应体系中，加入过量的只与双链DNA结合而不与单链DNA

结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光,

只有在DNA复制过程中掺入DNA双链才发出荧光。下列分析错误的是

（B）

2,来激活耐高温的DNA聚合酶

B.若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的

两种引物

解析:若要扩增DNA上的某一基因，应加入亥基因的两种引物。

9.（不定项）重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核昔酸链之间重叠的

部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方

法。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引

入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换

为赖氨酸（密码子为AAA、AAG）,从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理

如图所示。下列说法正确的是（ACD）

拟突变位点

引物4

553,

35

5

—y

—5'

昆合、变性后,杂交

____^—3'

-----5，

I⑤

5

3____A_____3'

-------A-----51

突变后的基因

注：引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程①需要模板、含\房•的缓冲液、引物、4种脱氧核甘酸和耐高

温的DNA聚合酶等

B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为G

C.经过过程④获得的杂交DNA有2种，只有其中一种可以经过过程⑤

获得目的基因

D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR

解析:若引物2的突变位点设计为A,则目的是让基因中的碱基对A-T

突变为T-A,步骤④获得的杂交DNA,一条链与引物2互补，另一条链

与引物3互补，所以引物2和引物3的序列互补，引物3的突变位点应

设计为T。

10.(不定项)(2022•北京高三专题练习)20世纪70年代,某科学家

发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图,在4支试管中分

别加入4种脱氧核甘三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核甘三磷酸(ddNTP);

ddNTP可以与dNTP竞争核昔酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。

在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同

长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法

中正确的是（ABC）

引物

5'i--------1?'

3'=H未知序列

+

dATP,dGTP^CTP.dTTP-

।।r।

+ddATP+ddCTP+ddGTP+ddTTP

B.ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核甘酸链的3,端

C.测得未知DNA的序列为5,—TCAGCTCGAATC—3

解析：电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟噂吟结尾。

二、非选择题

11.（2022•广东高三专题练习）如图为某种转基因抗病毒棉花培育过

程图，请据图回答下列问题。

抗病毒I愈伤|G|重:组|培养「国组质粒

植株组织细胞筛选［|受体细胞

（DPCR技术利用的基本原理是O利用该技

术扩增目标DNA片段（子链的延伸方向从51-3,），应选择图中的引

物（填字母）与模板DNA结合。

（2）PCR过程中，子链延伸需要引物的原因是

PCR技术通常需要长度为20〜30个核昔酸的DNA片段作为弓I物,如果

引物过短,则对扩增结果的影响是o

⑶在构建基因表达载体时，常用两种不同的限制前切割目的基因和

质粒,获得不同的黏性末端,其主要目的是防止和

反向连接。

⑷重组细胞经过G、H过程成功地培育出了转基因抗病毒棉花植株，

该过程利用了技术,其原理是o

⑸研究表明，转基因植物可以通过花粉将外源基因扩散到其他植物，

从而对生态环境造成潜在的危害。因此,科学家设法将目的基因整合

到受体细胞的叶绿体基因组中，这样做的目的是o

解析：（4）重组细胞经过G、H过程成功地培育出了转基因抗病毒棉花

植株,该过程利用了植物组织培养技术,其原理是植物细胞的全能性。

⑸花粉中含有精子,几乎不含细胞质，而受精卵中的细胞质几乎全部

来自卵细胞,所以科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基

因组中后，就不会通过花粉转移到自然界中的其他植物。

答案：（1）DNA半保留复制B、C

（2）DNA聚合酶只能将单个脱氧核甘酸连续结合到已有的核酸片段上

会扩增出更多的非目标DNA分子

（3）目的基因和质粒自身环化

（4）植物组织培养植物细胞的全能性

⑸防止目的基因通过花粉向其他植物扩散

12.（2022•天津和平区二模）转座子是指能从基因组的一个位置移动

到另一个位置的DNA片段。Ac片段能编码转座酶,可自主移动。Ds片

段需在转座酶作用下，才可以从原来的位置上切离下来,然后随机插

入所在染色体的其他位置或其他染色体上。

（1）用限制性内切核酸酶和DNA连接酶将Ds片段构建在Ti质粒的T.

DNA片段上,再用含有该重组质粒的土壤农杆菌转化水稻，自交筛选获

得Ds_T_DNA纯合体（甲）,以同样方法获得Ac-T-DNA纯合体水稻（乙）。

甲、乙杂交获得Ac/Ds双因子转座系统水稻,在其后代中筛选到一些

淡绿叶突变体。利用淡绿叶突变体与野生型水稻（甲）进行系列杂交实

验,（代）获得野生型和淡绿叶水稻植株分别为442株和130株，

分离比符合3：1,初步推测淡绿叶突变是单基因的性突变。

将442株野生型植株单株收获和播种，后代发生性状分离的植株

占，则进一步确认上述推测。

⑵为进一步确定突变性状与Ds发生切离转座的相关性,设计6种引

物（如图1）,对上述572株子代的T-DNA进行PCR检测。

①检测原理:Ds未发生