医学课件免疫自动化仪器分析

更多医学精品 尽在医学吧 /rayshiu 免疫自动化仪器分 析 概论 早期免疫分析通过观察沉淀物形成，凝集及溶血现象发 生来分析，如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、补体结合 等 上世纪 50年代末 60年代初，利用 AG-AB复合物形成使浊 度改变，再用比浊计来比浊，但因其敏感性差未被接受 70年代初，开始有自动检测系统，但因其用的是激光为 光源，固定波长，灵敏度较低，而且时间一般要 23 小时 概论 70年代未，速率比浊计的出现，使抗原抗体结合 的反应在几十秒内出结果，可以说是免疫化学测 定的革命的发展 随着标记技术的发展，免疫化学可以纳入临床化 学检验范畴 如今，自动化免疫分析系统更加飞速发展 自动化免疫分析的基础是抗原抗体的结合，具有 高特异性；手段多是利用标记技术而将检测信号 放大，具有高灵敏度 自动化 免疫仪器种类（应用技术） 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 免疫比浊 利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检 测的一种方法 此法准确快速，已成为免疫诊断技术中重 要的检测手段 比浊法与比色法 散射免疫比浊分析法 基本原理：抗原抗体复合物对一定波长的 光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度 与复合物粒子的大小和量有关（ 图 ） Rayleigh散射（ 图 ） Mile散射 Heidelberger曲线 定时散射比浊分析 基本原理：免疫沉淀反应和散射比浊分析 结合之技术，反应分两个阶段，预反应阶 段和反应阶段（ 图 ） 保证抗原不过量的方法： 确保反应体系抗体过量 对抗原过量进行阈值限定 预反应阶段 5ul样本 抗原过剩区 阈值 信号 反 应 阶 段45ul样本 7.5秒 2分钟 6分钟（ 2+4分钟） 定时散射比浊反应曲线图 抗原不过量 抗原过量 速率散射比浊分析 基本原理：抗原抗体结合反应的一种动态 测定法，适时检测抗原抗体复合物形成的 散射光信号 最快反应时间（ 图 ） 抗原过量检测（ 图 ） 抗原浓度递增 散射光峰值 峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图 A B C D F G H I 反应时间（秒） 0 60 85 散射率 抗体过量 抗原过量 第二峰值信号 抗原量检测速率峰 值信号产生 免疫透射比浊 基本原理：检测信号是通过溶液的光，测 量角度与正前方夹角为 0 （ 图 ），保持抗 体过量，形成可溶性 AG-AB复合物，使介 质浊度发生改变。 实验要求： 选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要 大、数量要多，反应时间充分。 单色器 透 射 比 浊 计 散射 比浊计 散射比浊和透射比浊的区别示意图 透射光 散射光 散射光 胶乳浊度测定法 基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均 匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时 ，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒 在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或 两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少 ，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度 呈正比，当然也与待测抗原量呈正比（ 图 ） 光波 胶乳浊度测定法原理 d d 2d 影响免疫比浊的因素 抗原抗体比例 抗体纯度和效价 增聚剂（ PEG） 自动免疫浊度分析仪的要求 校准程序，使仪器处于正常的工作状态 定标程序，保证检测结果的准确性 自动控制，保证实施实验条件中的抗原抗体反 应体系要求 自动系统，障碍的检测和预警。 自动化免疫仪器种类（应用技术） 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 化学发光自动免疫分析 化学发光是指在化学反应过程中产生光的发射现 象 基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物质在碱 性介质中氧化时产生激发态的中间体，中间体回 基态时产生辐射，多余的能量为发射光子，产生 发光现象，再对光信号进行接收转化，可得检测 物浓度 发光物质须具备：氧化致发光、光量子产额高、 理化性能好 化学发光自动免疫分析类型 化学发光免疫分析（ CLIA） 是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析 法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、 标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不 改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。 化学发光自动免疫分析类型 化学发光酶免疫分析（ CLEIA） 以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合 后，其中的酶可对发光体系产生催化作用 ，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的 量成正比。多用的发光体系是 HRP-鲁米诺 。 化学发光自动免疫分析类型 微粒子化学发光免疫分析（ ECIA） 也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载 体，增加反应体积和分离效率。标记的酶 多为 ALP。 化学发光自动免疫分析类型 电化学发光免疫分析（ ECLIA） 一种在电极表面由电化学引发的特异性化 学发光反应，实际上包括了电化学和化学 发光二个过程 ,其中应用了 “亲和素 -生物素 ” 放大系统，使检测的灵敏度大大提高 以双抗体夹心法为例之图示（ 图 ） ECLIA体系结构图 ECLIA检测流程图一（ 双抗体夹心的形成） ECLIA检测流程图二 （ 生物素与亲和素结合） ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面） ECLIA检测流程图四 （ 电极充电启动电化学反应） ECLIA检测流程图五 （撤 消磁场冲洗磁珠） 化学发光自动免疫分析 化学发光免疫分析是免疫技术、发光技术 和计算机系统的结合，具有特异性强、灵 敏度高（ pg/ml)、精密度好、准确度好等特 点，越来越多的人体微量指标应用这种方 法来检测，已渐渐代替了 RIA。 自动化免疫仪器种类（应用技术） 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 荧光免疫自动化 利用荧光物质标记抗原抗体的一种检测方 法 由免疫反应、荧光及计算机技术联合应用 的技术 主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振 免疫测定 荧光免疫自动化 时间分辨荧光免疫测定（ TRFIA）： AG- AB结合，某些荧光物质发长寿命荧光，时 间分辨技术 利用长寿命荧光物质（镧氏元素铕螯合物 ）标记抗原或抗体，测定过程中，可利用 延迟时间来消除非特异性的荧光干扰（ 图 ） 。 光强度 激发 短寿命荧光 长寿命荧光 延迟时间 测量时间 铕螯合物的激发、 发射光谱 荧光免疫自动化 TRFIA设计中的一些注意事项： Stakes位移（ 图 ） 解离增强 荧光免疫自动化 荧光偏振免疫测定：以小分子物质与大分 子物质的旋转差异而使它们对偏振光的吸 收不同为依据检测小分子药物 荧光酶免疫分析：标记酶参与反应 波长 300 400 500 600 700 Stakes 吸光度 Stakes 位移示意图 激发光 荧光 自动化免疫仪器种类（应用技术） 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 流式细胞仪 流式细胞仪（ FCM）是以激光为光源，检 测生物学颗粒理化性质的仪器 生物学颗粒包括免疫复合物、 DNA、 RNA 、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、 细胞、染色体、真核细胞等 理化性质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒 、 DNA含量、酶活性等 流式细胞仪 FCM综合了激光技术、电子技术、流体力 学、细胞化学及计算机技术，被称为实验 室 “CT” FCM现正广泛应用于细胞生物学、免疫学 、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临 床检验学等 流式细胞仪基本原理 基本原理：单个经荧光染料染色的细胞经 过激光激发后，发射的荧光在不同的角度 进行测量，并对其信号进行综合分析（ 图 ） 细胞分选原理：通过测量区的细胞若其参 数符合实验设计的条件，在经过偏转板时 被充上相应的电荷并被偏转收集（ 图 ） 液流系统：样本和鞘流液组成（ 图 ） 光学系统：光源可为汞灯或 激光 信号接收系统：散射光和荧光的检测 流式细胞仪基本组成 侧向荧光信号 鞘流 前向散射光 流式细胞流动池示意图 喷嘴 激光束 散射光的检测 信号的产生及强度（ 图 ） 前向散射光（ 图 ） 侧向散射光（ 图 ） 信号的产生 激光照射区 信号检测曲线 细胞中荧光素今量与信号的关系 信号的产生 细胞中荧光素今量与信号的关系 信号的产生 激光器 激光器 激光探测器 大颗粒 小颗粒 前散射光示意图 激光器 激光器 侧向散射光探测器 复杂颗粒 简单颗粒 侧向散射光示意图 荧光测量 荧光染料染色的细胞通过测量区时，细胞 中特异性荧光物质受激发产生荧光信号， 后者强弱表示待测物质的多少 荧光的检测系统由滤光片和检测器组成， 滤光片的作用是使激发光波长尽可能接近 荧光染料的激发光谱峰值，滤除非荧光信 号，提高荧光的检测强度 流式细胞仪免疫分析的技术要求 仪器性能指标：荧光分辨率、荧光灵敏度 、前向角散色光灵敏度、前向角散光分辨 率 、分析 /分选速度、分选纯度、分选收获率 检测样品要求要单细胞悬液 荧光标记常用的染料有异硫氰基荧光素、 藻红蛋白类 全程质量