（麻醉学专业论文）脊髓胶质细胞与nfκb信号转导通路在smir术后持续性疼痛中的作用.pdf

6 2 致谢6 3 论文声明0 0000g 6 4 论文审阅认定书6 6 9 5 6 3 8 8 距 孔 凹 弱 弘 奶 稻 鼹 铅 印 ，l 徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词 b s a c n s c o x c p t p e l i s a e t p 哂姆 m a - 1 i - r b i l 一1 p i n o s 取 i t m a p k m 口 m w t n f 1 c b p d t c a b b r e v i a t i o n 英文全称 b o v i n es e r u ma l b u m i n c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c y c l o - o x y g e n a s e c h r o n i cp o s t t h o r a c o t o m yp a i n e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b c n ta s s a y e x t r a - t e r r i t o r i a lp a i n g l i af i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n i o n i z e dc a l c i u mb i n d i n ga d a p t o r m o l e c u l e - 1 i n h i b i t o ro fk a p p a b i n t e r l e u k i n 一18 i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e i s c h e m i aa n dr e p e r f u s i o ni n j u r y i n t r a t h e 圮a li n j e c t i o n m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s m i r r o r - i m a g ep a i n m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d n u c l e a rf a c t o rk a p p a b p y r r o l i d i n ed i t h i o c a r b a m a t e p n s p e r i p h e r a l n e r v e o u ss y s t e m 中文全称 牛血清白蛋白 中枢神经系统 环氧合酶 开胸术后慢性疼痛 酶联免疫吸附法 泛域痛 胶质原纤维酸性蛋白 离子钙接头蛋白分子一1 核因子1 出抑制因子 白细胞介素一1 p 诱导型一氧化氮合酶 缺血再灌注损伤 鞘内注射 丝裂原活化蛋白激酶 镜像痛 机械缩足反射阈值 核因子r b 四氢吡咯二硫代氨基 甲酸酯 外周神经系统 ， 飞l ， t 2 。-。l 在 目的复制皮肤肌肉切口牵拉( s m m ) 术后持续性疼痛模型，动态观察s m i r 术后 持续性疼痛模型大鼠脊髓背角胶质细胞活化的变化，研究鞘内注射( i t ) n f r d 3 抑 制剂p d t c ( p y r r o l i d i n ed i t h i o c a r b a m a t e ) 对s m i r 术后持续性疼痛大鼠疼痛行为学及 脊髓t n f 0 【、i l 1 p 含量的影响。 方法( 1 ) 3 6 只雄性s d 大鼠随机分为空白对照( c o n t r 0 1 ) 组、假手术( s h a m ) 组和 s m i r 模型组，按f l a t t e r s 法制作大鼠s m i r 术后持续性疼痛模型，于术前及术后 第1 d 、3 d 、7 d 、1 2 d 、2 2 d 、3 2 d 用机械性缩足反射阈值( m 、w ) 和热缩足潜伏期 ( t w l ) 来评价疼痛行为学变化，电镜观察术后第1 2 d 隐神经损伤情况。( 2 ) 9 6 只雄性s d 大鼠随机分为s h a m 组和s m i r 模型组，分别于假手术或s m i r 术前及 术后第l d 、3 d 、7 d 、1 2 d 和2 2 d 应用免疫组织荧光实验观察脊髓小胶质细胞和星 形胶质细胞的增殖活化情况，w e s t e r nb l o t t i n g 法观察脊髓n f 1 出p 6 5 的表达变化。 ( 3 ) 1 5 0 只雄性s d 大鼠随机分为s h a m 组和s m i r 模型组，按鞘内给药不同将 s h a m 组分为s h a m + i t 生理盐水组( 无菌生理盐水1 0 p , 1i t ，组i ) 和s h a m + i t p d t c l o n g 组( p d t c1 0 n g 1 0 i t li t ，组i i ) 2 个亚组，s m i r 模型组分为s m i r + i t 生理盐水组( 无菌生理盐水1 0 “1i t ，组i i i ) ，s m i r + i tp d t c 2 n g 组( p d t c2 n g 1 0 t l i t ，组i v ) 和s m i r + i tp d t c l o n g 组( p d t c1 0 n g 1 0 p li t ，组v ) 3 个亚组，按y a k s h 法鞘内置管，按f l a t t e r s 法建立s m i r 模型，于术前及术后第1 d 、3 d 、7 d 、1 2 d 、 2 2 d 应用m w t 评价大鼠疼痛行为学变化，用酶联免疫吸附法( e n z y m e 1 i n k e d 徐州医学院硕士学住论文 i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 观察大鼠脊髓i l 1 d 和t n f a 含量的变化。 结果( 1 ) 疼痛行为学结果显示：与术前及c o n t r o l 组比较，s m i r 模型组术后第1 d 、 3 d 、7 d 、1 2 d 、2 2 dm w t 均显著降低( p o 0 5 ) ；而s h a m 组在各时间点m w t 无明 显区别：整个观察过程中s h a m 组及s m i r 模型组大鼠t w l 均无显著变化；与 s m i r + i t 生理盐水组( 组i i i ) 比较，i tp d t c l o n g ( 组v ) 大鼠在术后第7 d 、1 2 d 、 2 2 dm w t 均明显升高( p o 0 5 ) ，而i tp d t c 2 n g ( 组i v ) 大鼠m w t 无显著差异； s h a m + i tp d t c l o n g ( 组i i ) 与s h a m + i t 生理盐水组( 组i ) 比较，两者各时间点 m w t 均无明显差异。( 2 ) 电镜下观察隐神经损伤结果显示：s m i r 术及假手术后隐 神经均未出现髓鞘肿胀或脱髓鞘等神经损伤现象。( 3 ) 免疫荧光化学结果显示： 与术前基础值比较，术后各时间点大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的数 量和形态，s h a m 组无显著性差异，术后第3 ds m i r 模型组大鼠脊髓背角小胶质细胞 的数量显著增加，胞体突起增生肥大，呈激活状态，有显著性差异( 氏0 0 1 ) ；术 后第3 d 脊髓背角星形胶质细胞始增加，于术后第1 2 d 时数目增加最为显著( p o 0 1 ) ， 细胞呈显著激活。( 4 ) w e s t e r nb l o t t i n g 法测定n f r j 3p 6 5 蛋白表达量变化结果显示： 与术前基础值比较，s m i r 术后第1 d 大鼠脊髓即出现表达显著增加( 氏o 0 1 ) ，第 3 d 、7 d 较术后第1 d 有所降低，但仍较术前增加( 氏o 0 5 ) ；而s h a m 组大鼠各时间 点无统计学意义。( 5 ) e l i s a 钡j j 定脊髓i l 1 p 和t n f a 含量的变化：与术前基础值相 比，各时间点中s h a m 组各亚组脊髓i l 1 1 $ t 1 t n f a 含量均无显著性差异，而s m i r 模 型组各亚组大鼠的脊髓i l 1 p 和t n f a 含量分别于术后第3 d 和第7 d 始明显增加 ( p 0 0 1 ) ，其中与组i i i 与组比较无显著性差异，而组v 与组i i i 比较脊髓i l 1 p 和t n f 0 【含量均明显较低( 氏o 0 1 ) 。 结论：在本实验条件下，大鼠s m i r 术后表现出持续性机械痛觉过敏；脊髓小胶 质细胞及星形胶质细胞的激活与s m i r 术后持续性疼痛的产生及维持有关；脊髓 n f r j 3 的活化与s m i r 术后持续性疼痛的发生发展有关，其机制可能通过促进细 4 论文 子；脊髓；大鼠 徐州医学院硕士学位论丈 t h er o l e so fs p i n a lg l i aa n dn f - - k bp a t h w a yi nt h e m o d u l a t i o no fp e r s i s t e n tp o s t o p e r a t i v ep a i ne v o k e db ys m i r a b s t r a c t o b j e c t i v eu s i n gar a tm o d e lo fp e r s i s t e n tp o s t o p e r a t i v ep a i ne v o k e db ys k i n m u s c l e i n c i s i o na n dr e t r a c t i o n ( s m i r ) ，w eo b s e r v e dt h ec h a n g e so f 舀i ar e a c t i o ni nl u m b a r s p i n a lc o r da n dt h ee f f e c t so fi n t r a t h e c a l ( i t ) n f - r d 3i n h i b i t o rp d t c o nm e c h a n i c a l a l l o d y n i aa n dt h ec o n t e n to fi l - 11 3 t n f - ai nl u m b a rs p i n a lc o r d m e t h o d s ( 1 ) a r a tm o d e lo fs m i rw a se s t a b l i s h e da sf l a t t e r sd e s c r i b e d ，3 6m a l es d r a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t ot h r e eg r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ，s h a mg r o u pa n ds m i r g r o u p b e f o r eo p e r a t i o n ( b a s e l i n e ) a n da td a y1 ，3 ，7 ，12 ，2 ，3 2a f t e ro p e r a t i o n ，c h a n g e s o fp a i nb e h a v i o rw e r ea s s e s s e db ym e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ( m w t ) a n d t h e r m a lw i t h d r a w a ll a t e n c y ( t w l ) t h es t r u c t u r a ld a m a g e st o m y e l i ns h e a t ho f s a p h e n o u sn e r v ew e r eo b s e r v e dw i t he l e c t r o nm i c r o s c o p ea t12 da f t e rs u r g e r y ( 2 ) 9 6 m a l es dr a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t os h a mg r o u pa n ds m i rg r o u p t h e e x p r e s s i o n so fg f a p ，i b a la n dn f w _ bp 6 5p r o t e i ni nt h es p i n a ld o r s a lh o mw e r e a s s e s s e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dw e s t e r nb l o t t i n gr e s p e c t i v e l yb e f o r ea n da td a y 1 ，3 ，7 ，12 ，2 2a f t e ro p e r a t i o n ( 3 ) 15 0m a l es dr a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t os h a m g r o u pa n ds m i rg r o u p a c c o r d i n gt ot h ed r u g su s e d ，s h a mg r o u pw e r ef u r t h e rd i v i d e d i n t ot w og r o u p s ：s h a m + s a l i n eg r o u p ( s a l i n elo p li t ，g r o u pi ) ，s h a m + p d t c10 n g g r o u p ( p d t clo n g 10 1 x li t ，g r o u pi i ) ；s m i rg r o u pw e r ef u r t h e rd i v i d e di n t o3g r o u p s ： s m i r + s a l i n eg r o u p ( s a l i n elo t l i t ，g r o u p l l l ) ，s m i r + p d t c 2 n gg r o u p ( p d t c 2 n g 1 0 “li t ，g r o u p i v ) a n ds m i r + p d t c l o n gg r o u p ( p d t cl o n g l o l a li t ，g r o u pv ) i n t r a t h e c a lc a t h e t e r i z a t i o na n dt h es m i rm o d e lw e r ep r o d u c e da c c o r d i n gt oy a k s h s a n df l a t t e r ssm e t h o d sr e s p e c t i v e l y b e f o r ea n da td a y1 ，3 ，7 ，12 ，2 2a f t e rs u r g e r y , t h e p a i nb e h a v i o rw e r ea s s e s s e db ym w t a n dt h ec o n t e n to fi l 一1 1 3 a n dt n f - ai ns p i n a l c o r dw e r et e s t e db ye n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) r e s u l t s ( 1 ) d e t e r m i n a t i o no fp a i nb e h a v i o r ：c o m p a r e dt oe i t h e rc o n t r o lg r o u po r b a s e l i n e ，t h em w t i ns m i rg r o u pw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya td a y1 ，3 ，7 ，12 ，2 2 6 徐州医学院硕士学位论文 a f t e rs u r g e r y 衅o 0 5 ) t h em w ti ns h a mg r o u pd i dn o ts i g n i f i c a n t l yc h a n g e s m i r d i dn o ti n d u c es i g n i f i c a n th e a th y p e r a l g e s i a c o m p a r e dw i t hs m i r + s a l i n eg r o u p ( g r o u ph i ) ，t h em w tw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di n t h es m i r + p d t c10 n gg r o u p ( g r o u pv ) 眼0 0 5 ) b u tn o ts m i r + p d t c 2 n gg r o u p ( g r o u p i v ) a td a y7 ，1 2 ，2 2a f t e r s u r g e r y t h e r ew a s n os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eb e t w e e ns h a m + s a l i n eg r o u p ( g r o u pi ) a n ds h a m + p d t c10 n gg r o u p 【g r o u pi i ) ( 2 ) e l e c t r o nm i c r o s c o p yo fs a p h e n o u sn e r v e s e c t i o n sd i dn o ts h o wd e m y e l i n a t i o no ro e d e m ai nt h es a p h e n o u sn e r v eo ft h em o d e l g r o u po rs h a mg r o u p ( 3 ) i m m u n o f l u o r e s c e n c ec h e m i c a lm e t h o d ：c o m p a r e dw i t ht h e b a s l i n e ，t h ea c t i v a t e ds i t u a t i o no fm i c r o g l i ai nd o r s a lh o r no fs p i n a lc o r df r o mt h e v o l u m ea n ds h a p ec a nb es e e no b v i o u s l yi ns m i rg r o u p sa t3 da f t e ro p e r m i o na n dt h e a s t r o c y t e sw e r ea c t i v a t e do b v i o u s l yi ns p i n a ld o r s a lh o r na t12 da f t e ro p e r a t i o n t h e s h a mg r o u ps h o w e dn os i g n i f i c a n t l yc h a n g ea ta n yt i m ep o i n t ( 4 ) w e s t e r nb l o t t i n g ：a s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nl e v e lo fn f - r j 3p 6 5w a so b s e r v e di nt h es p i n a lc o r df r o md a y1 t od a y7a f t e rs m i r ( 5 ) e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a ys h o w e dt h a tc o m p a r e d w i t hb a s e l i n e ，a td a y3a f t e ro p e r a t i o n ，t h es p i n a lc o r dc o n t e n to fi l - 1pi n c r e a s e d o b v i o u s l yi nt h es m i rg r o u p s ，t h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( p 0 01 ) c o m p a r e d w i t ht h eg r o u p l i i ，t h es p i n a lc o r dc o n t e n to fi l - lpw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri ng r o u pv 0 0 5 ) c o n c l u s i o nu n d e rt h et e s tc o n d i t i o n ，p e r s i s t e n tm e c h a n i c a la l l o d y n i aw a se v o k e db y s m i ra n dc o u l db er e v e r s e db yn f 一1 c bi n h i b i t o rp d t c n f r d 3a c t i v a t i o ni ns p i n a l c o r dp l a y e dar o l ei ns m i r i n d u c e dm e c h a n i c a la l l o d y n i ao fr a t s n f - r bp a t h w a ym a y p l a yar o l ei np o s t o p e r a t i v ep e r s i s t e n tp a i nt h r o u g ht h ei n c r e a s eo fc y t o k i n e si l - i1 3 ， t n f - a a c t i v a t e dm i c r o g l i aa n da s t r o c y t e sm i g h tb ea s s o c i a t e dw i t ht h em e c h a n i s mo f p e r s i s t e n tp o s t o p e r a t i v ep a i ne v o k e db ys m i r k e yw o r d s ：p a i n ；g l i a ；n f r b ；c y t o k i n e ；s p i n a lc o r d ；r a t 7 徐州医学院硕士学位论文 击鲁士 翮舀 术后持续性疼痛( p e r s i s t e n tp o s t o p e r a t i v ep a i n ) ，也称为慢性手术后疼痛综合征 ( c 1 1 r o m cp o s t s u r g i c a lp a i ns y n d r o m e ) 。研究报告指出多种手术如腹股沟疝修补术、开 胸手术、剖宫产手术等都常伴发术后持续性疼痛。p e r k i n s 1 】等报告开胸手术病人 3 0 6 0 出现术后持续性疼痛并且持续到术后3 个月到3 0 个月不等，同时还观察到 腹股沟疝修补术后疼痛也同样长时间持续存在，而美国每年约有6 0 0 0 0 多例病人腹 股沟疝修补术后发生持续性疼痛。因此术后持续性疼痛是一个广泛存在的问题， 其不仅是一种伤害性感受，往往还同时伴有炎性疼痛、神经病理性疼痛及内脏疼 痛等，对病人造成极大的痛苦，严重地影响病人的康复和生活质量。然而目前其 发生发展机制尚不清楚，且治疗手段单一，治疗效果欠佳。因此，术后持续性疼 痛的发生发展机制和治疗策略是目前国内外学者关注的研究课题之一。 有关术后持续性疼痛的形成机制尚不清楚，目前认为可能与来源于皮肤切口、 炎症或肌肉损伤的伤害性感受、或与来自手术引起外周神经损伤的神经病理性疼 痛、或与多个可能的病理机制的联合作用有关。许多研究提示神经系统的外周敏 感化( p e r i p h e r a ls e n s i t i z a t i o n ) 和中枢敏感化( c e n t r a ls e n s i t i z a t i o n ) 在疼痛的发生和发 展中发挥着重要的作用。有害刺激反复和长时间刺激损伤后的组织或和神经能使 神经元的功能、生物化学、甚至结构发生改变，从而使疼痛的敏感性增加。伤害 性感受器的外周敏感化和随后进入脊髓的大量神经冲动使脊髓背角神经元的兴奋 性明显增加而导致中枢敏感化，从而使疼痛的阈值降低和对疼痛的反应进一步扩 大。这些神经可塑性改变构成了病理性疼痛发生发展的基础。 众所周知，中枢神经系统( c n s ) 内胶质细胞在数目远远多于神经元。而近年来 随着对胶质细胞研究的深入，发现胶质细胞虽然不能进行传统意义上的信息传递， 但它的功能也不仅仅只限于在对神经元起支持和营养等辅助作用，其在c n s 内多 元结构和功能的 觉的持续状态。 此外还有研究发现多种伤害性刺激可以引起胶质细胞的激活，而激活的胶质细胞 是c n s i 勾细胞因子的主要源泉【2 卅。当胶质细胞尤其是小胶质细胞和星形胶质细胞 被激活时，能产生和释放大量的与疼痛相关的细胞因子如i l 一1 1 3 、i l 6 、t n f 0 【等， 它们通过自分泌和旁分泌参与脊髓水平的痛觉调制，导致痛觉过敏和痛觉超敏【4 、6 】。 同时胶质细胞既是细胞因子的源泉又是其靶点【7 1 ，在慢性疼痛中，胶质细胞被大量 激活从而直接或间接的产生大量炎症介质或细胞因子，一方面大量细胞因子可进 一步促进胶质细胞增生，另一方面活化的胶质细胞又可产生更多的细胞因子，两 者相互作用，从而形成慢性疼痛的瀑布式放大效应，加强慢性疼痛形成。另外各 种细胞内及细胞间存在信号传导通路，星形胶质细胞之间，星形胶质细胞和神经 元之间，星形胶质细胞和小胶质细胞之间形成广泛而复杂的神经通讯网络，进行 各种细胞信息的传递，这也是它们参与疼痛信号调节的物质基础。 其中，与细胞因子密切相关的信号通路包括核因子1 c b ( n u c l e a rf a c t o r - k a p p a b ， n f r , b ) 信号转导通路和丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ， m a p k ) 信号转导通路等。n f r d 3 是一种重要的转录因子，是1 9 8 6 年s e n 和 b a l t i m o r e 首次发现的一种能与免疫球蛋白1 c 链基因增强子b 位点( g g g a c t t t c ) 结合、调节免疫球蛋白k 链基因转录的核蛋白因子【8 1 ，其是由n f r , b r e l 家族蛋白 构成的同源或异源二聚体复合物，p 5 0 p 6 5 是n f r b 最常见的二聚体形式。静息状 态时，n f r , b 通常以二聚体形式与其抑制因子i 1 c b ( i n h i b i t o ro f k a p p a b ) 非共价结 合形成三聚体，以非活性的形式存在于胞浆中。当细胞受到刺激时，其与膜受体 特异结合并改变受体空间构象，从而使n f r b 诱导性激酶( n f r b i n d u c i n gk i n a s e ， n i k ) 激活，n i k 进一步激活i r d 3 激酶( i r bk i n a s e ，i k k ) ，i k k 可使i r , b 发生磷酸 化，从而n f r b 得以释放出来并转位到胞核，与靶基因启动子区域的的r b 序列特 9 徐州医学院硕士学位论文 异性结合并上调这些靶基因的表达【9 1 。而这些被转录调控的靶基因中有2 7 种为细胞 因子及趋化因子如i l 1 b ，i l 6 ，t n f 仅等，因而n f 1 出又被认为是“免疫反应的中枢 调质( c e n t r a lm e d i a t o ro f t h ei m m u n er e s p o n s e ) ” 1 0 】。而f 1 n f 1 c b 广泛分布于体内各 种细胞中，在c n s 内，星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞及神经元中都 有n f r d 3 表达【1 1 】。近年来研究发现n f r d 3 与病理性疼痛密切相关，多种病理性疼痛 模型中都存在n f 1 c b 的激活【1 2 - 1 4 】) 。在慢性疼痛中，特异性n f r d 3d e c o y 或n f r d 3p 6 5 反义寡核苷酸能通过抑制神经损伤部位致炎性细胞因子如t n f a 、i l 1 b 、i l 6 、可 诱导性一氧化氮合酶( i n o s ) 、干扰素( i f n ) - 丫、趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白 等而显著抑制外周神经损伤诱发的热痛敏及机械性痛觉过敏的产掣1 5 】) 。以上研究 均提示，n f r d 3 信号转导通路及其下游产物致炎性细胞因子参与了病理性疼痛信号 的调节。 大鼠皮肤肌肉切口牵拉( s k i n m u s c l ei n c i s i o na n dr e t r a c t i o n ，s m 瓜) 致术后 持续性疼痛模型是由2 0 0 8 年由f l a t t e r s t l 6 1 首次提出的一种新的术后持续性疼痛模 型，简称为s m i r 模型。该模型主要是通过长时间牵拉皮肤肌肉组织，不损伤切 口周围主要神经而引起术后持续性疼痛。研究表明大鼠s m i r 术后观察到显著的 机械性痛觉过敏，在术后第1 0 到1 3 天最为显著，至少持续到术后2 2 天，术后 3 2 天逐渐消散。其操作过程模拟临床外科手术操作，为探讨术后疼痛机制和治疗 提供了一种有效的新手段。 尽管在其他疼痛动物模型中发现脊髓胶质细胞和n f r b 信号转导通路在疼痛 的中枢敏感化过程中具有重要作用，但这些动物模型无论是疼痛形成机制还是疼 痛行为过程都与术后持续性疼痛存在明显不同。因此，我们在首先复制s m 瓜模型 的基础上，应用疼痛行为学观察法、免疫荧光法、w e s t e r nb l o t t i n g 法和e l i s a 法等 技术研究脊髓胶质细胞与n f k b 及其下游的促炎性细胞因子t n f g t 、i l 一11 3 在术后 持续性疼痛中的可能作用，以进一步阐明术后持续性疼痛的发生发展机制。 1 0 性疼痛模型 团上海公司 c o a s tm e d i c a l 公司 辐射热痛敏刺激仪中国浙江大学光学系研制 电镜照相系统h 6 0 0 型日本国株式会社日立制作所 手术器械：包括组织剪，线剪，手术刀片，眼科剪，眼科小弯镊，持针器，有齿 镊，可吸收线，牵拉器等，均自备。 1 3 实验动物健康成年雄性s d ( s p r a g u e - d a w l e y ) 大鼠( 体重2 0 0 - 2 5 0 9 ) ， 由徐州医学院实验动物中心提供。动物置于2 4 士2 。c 室温下，和1 2 h 1 2h 昼夜照明 的环境中，自由摄食摄水。所有实验动物适应环境2 d 后入实验。本实验均遵从国 际疼痛研究联合会相关指南，以尽量减少实验动物数目及对实验动物的伤害为原 则，并经徐州医学院实验动物伦理委员会的许可。 2 、实验方法 2 1 动物分组3 6 只雄性s d 大鼠随机分为空白对照( c o n t r 0 1 ) 组、假手术( s h a m ) 组和s m i r 模型组，每组1 2 只，其中每组大鼠随机取4 只用于术后第1 2 d 时取 隐神经进行电镜观察。s m i r 模型组大鼠按f l a t t e r s 法【埔】实施s m i r ，s h a m 组大鼠 除未进行s m i r 之外其他操作均与s m i r 模型组相同，空白对照组不做任何处理。 2 2 大鼠s m i r 模型的建立按f l a t t e r s 法【1 6 】建立大鼠s m i r 模型。大鼠在戊巴比 妥钠腹腔注射( 4 0 m g k g ) 麻醉后置于仰卧位固定，一侧腿部皮肤剃毛后使用7 5 酒精反复拭擦消毒并使隐静脉清晰可视。在大腿中部隐静脉内侧4 m m 处做一长 1 5 2 c m 的皮肤切口暴露腿部肌肉，然后于浅层肌肉( 股薄肌) 做一长7 1 0 m m 切 口，钝性分离浅层肌肉，见白色的内收肌群肌腱筋膜后，切口内置入显微牵开器。 将牵开器尖头置入浅层肌肉下后拉开皮肤肌肉至2 c m ，暴露内收肌群筋膜，持续 牵拉1 h 。在牵拉过程中，隐神经被牵开器拉伸并移位，但由于其处于肌肉表层而 并没有受坚硬物体如骨头等的压迫。牵拉期间大鼠给予切口处无菌生理盐水纱布 覆盖保湿并保温，1 h 后缝合皮肤肌肉，手术后常规给予抗生素抗感染治疗。 2 3 行为学测定所有大鼠分别应用v o nf r e y 纤维细丝法( 机械性痛觉过敏) 【1 7 1 和h a r g r e a v e s 澍1 8 】( 热痛觉过敏) 测定术前及术后第1 d 、3 d 、7 d 、1 2 d 、2 2 d 、3 2 d 的机械性缩足反射阈值( m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，m w t ) 和热缩足潜伏期 ( t h e r m a lw i t h d r a w a ll a t e n c y , t w l ) ，并且本实验中所有疼痛行为学观察过程均采 用双盲法。 2 3 1m w t 的测定用v o nf r e y 纤维细丝( 折力梯度分别为1 0 、1 4 、2 0 、 4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 、1 5 0 曲以u p d o w n 法推算5 0 缩足阈值【1 8 】：将一有机玻 璃箱( 2 2x 1 2x 2 2 ) c m 3 置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应1 5 m i n 后处 于静止时，用v o nf r e y 纤维细丝垂直刺激大鼠手术侧后肢足底中部，持续时间 4s ，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定时首先从折 力2 0g 开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大一级力度的刺 激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第 1 次阳性和阴性反应的骑跨，每个折力的纤维细丝均连续测定5 次，每次刺激间 隔3 0 s ，5 次当中有3 次或3 次以上的阳性反应视为有机械痛敏，计算这个折力的 阳性反应百分率( 即测定5 次当中阳性次数的百分率) 称为最大折力阳性百分率， 这个折力也称为最大折力；低于3 次者则计算能引起阳性反应的最小折力的阳性 1 2 徐州医学院硕士学位论文 百分率，通过公式：最大折力值一 ( 最大折力一最小折力) ( 最大折力的阳性率 一最小折力阳性率) ( 最大折力的阳性率- - 5 0 ) 求出5 0 阳性反应的值即 m w t 。最大力度为1 5g ，大于此值时记为1 5g 。 2 3 2t w l 的测定将有机玻璃箱置于3m m 厚的玻璃板上，大鼠适应环境3 0 m i n 后用热痛刺激仪( 1 0 v , 5 0 w ；光斑直径0 8 c m ) 照射大鼠足底。照射开始至大鼠出 现抬腿回避时为t w l 。自动切断时间为2 5 秒，以防止组织损伤。热刺激强度在 整个实验过程中维持一致，并保持检测室内温度恒温。每只动物测定5 次，每次 间隔3m i n ，取后3 次平均值为大鼠t w l 值。 2 4 电镜实验术后第1 2 d 时，动物在戊巴比妥钠腹腔注射( 6 0 m g k g ) 深麻醉下 迅速开胸暴露心脏经升主动脉依次灌注4 c 生理盐水( 1 0 0 m 1 ) 、4 多聚甲醛( 4 0 0 m l ，o 1 mp b s ，p h 7 4 ) 。之后取灌注好大鼠手术侧隐神经，样品用磷酸缓冲液 ( o 0 1 mp b ，p h 7 4 ) 冲洗，先后用2 5 戊二醛和1 锇酸进行固定，0 0 1 mp b 清 洗，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，聚合，超薄切片机切片后进行染色，最后电 镜下观察、拍片。 2 5 统计学处理数据采用均数士标准差( x 士s ) 表示，采用s p s s l 3 0 统计软件 进行数据处理。组内比较采用配对t 检验，组间比较采用单因素方差分析，两两 比较采用g 检验。检验水准取a = 0 0 5 ，p 0 0 5 认为有统计学意义。 徐州医学院硕士学位论文 结果 在s m i r 模型组和s h a m 组大鼠均未出现任何神经切断的症状，s m i r 术后大 鼠无异常现象如切口感染、脱毛、腹泻或者体重减轻等症状。 1 、行为学变化 1 1m w t在y o nf r e y 折力测试中，s m i r 模型组大鼠表现出显著的持续机械性 痛觉过敏。与空白对照( c o n t r 0 1 ) 组比较，s m i r 模型组大鼠术后第1 d 即出现m w t 下降( 户 o 0 5 ) ，术后第1 2 d 下降最为明显( p o 0 1 ) ，并持续至术后第2 2 d ( p 0 0 5 ) ， 术后第3 2 d 逐渐恢复至术前水平，而空白对照组与s h a m 组各时间点比较，m w t 无明显区别( f i g l ，t a b1 ) 。 t a b1 t h ec h a n g e so fm w ti nar a tm o d e lo fp e r s i s t e n tp o s t o p e r a t i v ep a i ne v o k e db y s m i r ( g ，n = 8 ，x 虹) + ：p o 0 5 ，”：氏o 0 1v sc o n t r o lg r o u p ；撑：p 0 0 5 2 、电镜观察结果 术后第1 2 d 时取切口段隐神经进行电镜下观察其神经损伤情况，结果表明 s m i r 模型组和s h a m 组大鼠手术侧隐神经髓鞘形态规整，排列紧密均匀，结构完 整，板层致密，轴索居中无肿胀，无髓鞘脱落、肿胀、增厚等现象。结果表明大 鼠s m i r 术及假手术后均未发现隐神经损伤情况出现( f i g 3 ) 。 徐州医学院硕士学位论文 第二部分 s m i r 模型大鼠脊髓胶质细胞增殖活化 及n f k b 表达的动态变化 1 、材料 1 1 主要药品与试剂 小鼠单克隆抗g f a p 抗体 兔单克隆抗n f r d 3 p 6 5 抗体 羊抗i b a - 1 抗体 驴抗小鼠t r i t c _ _ 二- - 抗 羊抗兔f i t c z 抗 驴抗羊f i t c h - - 抗 碱性磷酸酶标记抗兔i g g 碱性磷酸酶标记羊抗兔i g g 多聚甲醛( 分析纯) 氯化钠( 分析纯) 蔗糖( 分析纯) 磷酸二氢钠( 分析纯) 磷酸氢二钠( 分析纯) 戊巴比妥钠 牛血清白蛋i 刍( b s a ) n c 膜 材料和方法 1 6 美nc e l ls i g n a l i n g 公司 美 nc e l ls i g n a l i n g 公司 美国a b c a m 公司 美国s a n t ac r u z 公司 美国s a n t ac r u z 公司 碧云天公司 s i g m a 公司 北京中杉金桥公司 南京化学试剂厂 南京化学试剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 江苏省宜兴市第二化学试剂厂 江苏省宜兴市第二化学试剂厂 中国医药集团上海公司 美国a m e r s h a m 公司 美国a m e r s h a m 公司 徐州医学院硕士学位论文 匀浆液 t r i s h c l s d s w e s t e r nb l o t t i n g 试剂盒 预染蛋白质分子量标准 s d s p a g e 蛋白上样缓冲液 w e s t e r n - - 抗稀释液 w e s t e m - - 抗稀释液 r i p a 裂解液 b c m ，n b t 碱性磷酸酶显示试剂盒 其余试剂均为国产分析纯a r 级 1 2 主要仪器设备 v o nf r e y 纤毛刺激仪 辐射热痛敏刺激仪 恒温箱 h s s 1 数字式超级恒温浴槽 高速离心机 h a r r i s 超低温冰箱 微量进样器 组织超声匀浆机 w e s t e r nb l o t t i n g 套件 t s 1 型脱色摇床 电泳仪 转移槽 1 7 碧云天生物有限公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 碧云天生物有限公司 碧云天生物有限公司 碧云天生物有限公司 碧云天生物有限公司 碧云天生物有限公司