（预防兽医学专业论文）根霉发酵大豆食品——丹贝的营养及安全性研究.pdf

摘要 摘要 经实验研究，丹贝的发酵工艺初步可定为：精选大豆一浸泡1 8 - 2 4 h 0 0 8 m p 蒸煮 2 0 r a i n - 力口入o8 乳酸接入固体菌种分装( 容器) 3 6 ( 1 ) 培养3 0 h 对丹贝含氮营养物质的测定表明：非蛋白氮( n p n ) 组分及可溶性蛋白含量均较发酵 前显著增加。其中非蛋白氮总量、n 氨基氮、多肽氮增量分别为1 2 7 、6 6 、3 8 9 倍，游 离氮基酸总量增幅可达3 倍，n s i 、水溶性蛋白、醇溶性蛋白分别为发酵前的4 5 1 、1 9 4 、 1 3 0 倍。同发酵3 0 h 的丹贝相比，发酵4 8 h 的丹贝中各含氨营养成分的含量均无明显变化。 对丹贝的主要脂类营养物质进行测定，结果表明，发酵3 0 h 时的丹贝与未发酵样品 相比：脂类总量变化不明显：酸价、碘价增长了3 7 倍、15 ；四种不饱和游离脂肪酸， 即亚麻酸、亚油酸、油酸、花生四烯酸依次增加6 9 、3 4 、9 3 和7 1 倍。3 0 h 以后丹贝中 脂类营养物质的变化均不显著。 对丹贝维生素b l 、b 2 、b 1 2 测定结果表明发酵到3 0 h 时分别较发酵前增长2 1 6 倍、 1 7 1 倍、3 3 3 倍，同发酵3 0 h 的丹贝相比发酵4 8 h 的丹贝中三种维生素含量均无显著 变化。 对丹贝的安全性进行了检测，结果为：半数致死量( l d j o ) 1 5 0 9 k g 体重：微核实 验、精母细胞染色体畸变实验、精子畸形实验和a m e s 实验结果均为阴性，铅、砷、a f b 】 含量均在安全标准以下，因此丹贝是种安全食品。 对丹贝的总菌数及大肠菌群最近似数( m p n ) 进行测定，实验结果表明发酵到3 0 h 时其总菌数和大肠菌群m p n 分别为4 1 x 1 07 、 1 5 ，0 # k g ，t h er e s u l t so f m i c r o k e r m e lt e s t ，s p e r m m o c ”e s c h r o m o s o m ea b e r r a t i o nt e s t ，s p e r m m a l f o r m a t i o nt e s ta n da m e st e s ta l lw e r en e g a t i v e t h e c o n t e n t so f p b - a sa n da f b la l lw e r e b e n e a t ht h es t a n d a r do f n a t i o nf o o ds a f e t y s o ，t e m p ew a s ak i n do f s a f ef o o d i tc o u l db ek n o w nt h a tt o t a lb a c t e r i aq u a n t i t ya n dc o l i f o r mg r o u p m o s tp r o b a b l en u m b e r r m p n ) o f t e m p e t h a t h a db e e n f e r m e n t e d f o r 3 0 h a r e 4 1 1 0 。、 发酵i 3 天，即成白色、发酵成熟的丹贝。现在，已有 人对其进行了改进。如在成品制成后，再加盐进行1 5 3 0 天的后发酵，这样可鞋丰富其 风味并进一步提高其营养价值：还可在发酵前期将菌种和大豆置于滚筒内搅拌，以利于 菌种充分接触发酵基质。 9 东北农业大学农学硕士学位论文 1 3 3 发酵基质生化交化及丹贝营养 丹贝的发酵周期很短，4 8 h 内即可完成。制作大豆丹贝时，大豆只是稍加蒸煮 ( 3 0 r a i n ) 。子叶相当坚硬，要把它煮软最少得6 h 。但经根霉发酵后大豆，软得像充分蒸 煮一样。原以为大豆组织软化，主要靠蛋白酶分解蛋白质造成，后经组织切片研究发现， 根霉菌丝可渗入到大豆子叶7 2 4 u m 深度相当于子叶中菌丝分泌各种酶渗透到大豆组 织内部的途径大大缩短，酶解作用必然明显加速。 去皮大豆经少孢根霉发酵后，粗蛋白含量虽无显著增加( p 0 0 5 ) ，但可溶性蛋白、 氨基酸态氮和可溶性固形物含量均有大幅度增长，虽然各来源的数据不完全相同，但总 的来说增幅分别为3 6 倍、2 7 倍和7 1 9 倍，可溶性指数也有明显提高，游离氮基 酸总量增加十余倍。这也表明少孢根霉有较强蛋白分解能力，分解产生许多小肽和氨基 酸，易被人体消化吸收，从而也改善了大豆蛋白消化吸收性。另外，发酵后f e 、z n 等 元素也有所增加。近l 3 脂肪被分解降解产生大量的游离脂肪酸但部分亚油酸和a 亚麻酸被根霉利用。 在发酵丹贝中，钻胺素，菸酸、核黄素、尼克酸、尼克酰胺及硫胺紊等水溶性维生 素均有所增加。但是，少孢根霉只能产生菸酸、核黄素、尼克酸、尼克酰胺等，而不具 备产生钴胺素和硫胺素的能力，但丹贝发酵后钴胺索明显增加。钴胺素主要是丹贝发酵 时的伴生细菌，弗氏柠檬酸菌和一种克雷伯氏菌产生的，弗氏柠檬酸菌还会产生一定量 的硫胺素( k e u t hs 1 9 9 4 ) , 。不单是在发酵过程中，在浸泡大豆时也会有大量钻胺素产 生，若浸泡大豆的水为酸性，就会引起柠檬酸菌和乳酸菌等细菌的滋生，它们会使大豆 中钴胺素大量增加( a s h e n a i lm ，1 9 9 1 ) 。 未发酵大豆消化率为6 0 - - 6 5 大豆粉7 5 ，大豆组织蛋白8 3 8 5 ，豆浆8 4 9 ， 肉类9 2 - 9 4 。经大鼠氮代谢实验结果表明，丹贝表现消化率达9 4 4 ，真实消化率为 9 1 4 ，消化率的提高主要是因为大豆中阻碍消化的纤维索被破坏和降解，并且蛋白被 大量水解为多肽和游离氨基酸。化学评价结果表明，发酵后蛋白质的氨基酸分( a a s ) 、 化学生物价( c a 、必需氮基酸指数( e e a i ) 及计算蛋白质功能比值( c p e r ) 依次为6 3 0 、 6 7 ，1 、8 3 0 和2 9 i ，分别比大豆高2 7 、1 2 、1 9 8 和3 8 ，1 。 少孢根霉还能分泌活力很强的植酸酶，该酶在酸性条件下能将大豆中大量的植酸分 解，提高其矿物质的利用率。发酵后丹贝中植酸含量降低约7 3 5 。 1 3 4 丹贝异黄酮和其他活性物质 研究表明丹贝发酵过程中大豆原有的异黄酮总量变化不大，但其存在形式变化较明 显，其总趋势是：随着发酵时间的延长异黄酮塘苷含量逐惭降低在发酵最终产物中异 黄酮主要以染科木素和黄豆苷元两种苷元形式存在。在发酵前期大部分异黄酮由糖苷转 化成苷元在这段时间内少孢根霉的菌丝体生长最旺盛。这是因为在菌丝体生长时需要 大量营养，作为碳源的糖分消耗量很大，而大豆中可利用的游离萃耱较少微生物必须 分泌大量的葡萄糖苷酶来分解各种含糖底物以获取需要的糖分。这样异黄酮糖苷中的糖 分被分解利用而产生不被微生物利用的苷= 元。j i 龛少孢根霉外，丹贝中的某些微球菌和节 o 杆菌也有分解异黄酮糖苷的能力。 在丹贝中主要有两种异黄酮：6 、7 、4 一三羟异黄酮( 染料木素) 、6 、4 一二羟异 黄酮( 黄豆苷元) 。研究表明，丹贝异黄酮具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤能力，尤其是对乳 腺癌抗性特强。以丹贝为主食的东南亚人直肠癌、前列腺癌和乳腺癌患病率明显低于_ 西 方国家，其中一个重要原因就是丹贝异黄酮有较强的抗癌活性，目前，美国癌症研究中 心已把它列为抗肿瘤药物之一。国外动物实验和细胞培养实验证实，丹贝异黄酮有很强 的抑制肿瘤生长作用。丹贝异黄酮中的染料木素含量更高，其抗癌活性也更强。研究表 明染料木素不完全是通过细胞毒作用直接杀死癌细胞的。染料木素在体内能与雌激素受 体( e r ) 作用，而e r 能将其在靶细胞内浓缩，因此在体内实际上染料木紊在很低浓度 时己发生作用。据报道染料木素是很强的p t k 酶抑制剂，而这种酶可刺激新血管的形成 以供恶性肿瘤细胞氧气和养分，染料木素通过抑制p t k 酶阻断新血管的生成达到防癌抑 癌的作用，染料木索还可能通过清除自由基对肿瘤细胞产生抑制作用( a k i y a m a ，1 9 8 7 ) 。 丹贝中异黄酮有很强的抗氧化能力。冷冻干燥丹贝在3 7 c 条件下保存5 个月，其氧 化值从6 增到1 2 ，而大豆氧化值却由6 增至4 2 6 。丹贝异黄酮提取物在高温下对植物油 的抗氧化性明显好于茶多酚和b h t 等通用抗氧化剂。所以，有人利用丹贝的特点，把它 和淀粉混合在一起制作脂肪含量较高的食品比如丹贝红肠和丹贝冰淇淋。这样做能加 强食品抗氧化性、延长货架期，而且还可增加食品蛋白质含量，改善其营养成份。丹贝 异黄酮对正常大鼠肝匀浆体外脂质过氧化终产物丙二醛的生成具有明显的抑制作用，并 对可导致细胞衰老的o ，一和o h 有明显的清除作用。因此有理由认为丹贝异黄酮是 一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，可用于各种保健品中以增强其抗衰老作用。 对丹贝异黄酮抗菌实验表明。其至少对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、产气英膜梭菌 及生孢梭菌等七种革兰氏阳性苗有明显抑制作用。还可杀死某些有害真菌，有报导说它 能降低发酵基质中黄曲霉毒索的含量。因此以丹贝粉为添加剂制成其他食品时可推迟其 腐败时间，丹贝红肠的总菌数要低于普通红肠，生霉时闯也会延长。由于少孢根霉不能 利用大豆中的蔗糖、棉子糖和水苏塘( 又称胃涨气因子) ，而且丹贝含有和大豆相同量的 低聚糖，按理说吃了它会造成涨肚现象。但食用丹贝不会产生涨肚，或者不超过一般情 况这就是丹贝异黄酮在一定时间内抑制肠道微生物的缘故。 除异黄酮外，丹贝中还富含其他的一些生物活性物质。如：少孢根霉在丹贝发酵过 程中能产生抗菌素，这类抗菌素特点是：有多肽结构和碳水化合物结构。其活性不受胃 蛋白酶和少孢根霉自身蛋自酶影响，胰蛋白酶和肽酶对它稍有影响。s i n y a k 从少孢根霉 分泌物中分离到一种短肽，证实其对乳酪链球菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有明 显抑制作用。另外，丹贝中伴生的乳酸菌、胚芽乳杆菌等微生物还会产生一些杆菌素等 抗菌物质，抑制产肠毒素大肠杆菌和李氏杆菌等病原菌。还有研究证实少孢根霉可在发 酵过程中分泌在医药、化妆品方面应用广泛的、活性很强的超氧化物歧化酶( s o d ) t 它 会进一步提高丹贝的抗氧化性和抗衰老功能( 张羽航，1 9 9 8 ) a 1 3 5 新型的丹贝品种 实际上，不是只有大豆和少孢根霉纯菌才能制成丹贝，在国外还用其他豆类和谷物 1 1 为原料、以其他微生物作辅助菌种来制作丹贝，现作如下介绍： i ) 用玉米一大豆( 7 ：3 ) 作发酵基质，以少孢根霉一米根霉( 1 ：1 ) 发酵可制成营养 丰富的丹贝。其中低聚糖、游离脂肪酸和氨基氮分别较未发酵对照样提高4 3 、1 9 5 、 4 8 2 植酸减少4 6 ，蛋白质效率( p e r ) 和蛋白净利用率( n p r ) 分别达到27 1 和 3 3 1 ，消化率为9 5 。 2 ) 甜杏仁和苦杏仁均可以少孢根霉发酵制成有特别风味的丹贝。其粗蛋白、粗脂肪、 粗纤维和碳水化合物分别达到2 1 、5 2 、1 5 和2 6 。苦杏仁含有一种有毒物质一 苦杏仁素，对人体有害，不过它可通过发酵前的加热处理和发酵过程中解毒作用而除去。 3 ) 将甜高梁和菜豆以2 ：3 混合，用少孢根霉一米根霉( 1 ：1 ) 发酵可制成丹贝。发 酵后其粗蛋白、粗脂肪和灰分显著增加，而碳水化合物有所减少。膳食纤维增加1 0 ， 低聚糖、游离脂肪酸和氨基氮分别增长1 5 3 倍、67 倍和4 6 倍，植酸降低4 4 ，p e r 和n p r 分别达到1 6 1 和2 3 9 。 4 ) 印尼人能用少孢根霉发酵棉籽来制作丹贝。棉籽中有一种黄色素一棉籽酚是种 有毒物质，但它在发酵过程中会被失活。棉籽丹贝的口味较差，但如将棉籽和脱脂大豆 以1 ：l 混合后发酵可改善其风味，其中的氨基酸及维生素等营养物质也明显增多胃涨 气因子则显著减少。 5 ) 在坦桑尼亚，人们用甜高梁和芝麻、绿豆、大豆等经少孢根霉发酵制作丹贝。发 酵后其蛋白含量由1 6 升至1 8 6 氨基酸分由6 3 升至6 9 ，净蛋白能和总能量分别由 7 3 、4 1 6 k e a l 1 0 0 9 增至8 ，4 、4 4 l k c a l 1 0 0 9 。因其蛋白和能量较高，故可用作断奶食 品，还可制成油炸快餐。 6 ) 鹰嘴豆浸泡后经少孢根霉发酵可制成可口的、营养丰富的丹贝。3 6 c 发酵4 3 h 后消化率可达8 3 、赖氨酸含量( 占总氪基酸) 为7 8 、植酸降至0 2 。 7 ) 在尼日利亚，人们将豇豆和大豆混合再配以玉米粉，经少孢根霉发酵可制成高 蛋白、有香草味的丹贝。如再将其磨碎，加水调成密度为0 6 8 o 7 5 9 m l 的粥状物t 即 可制成一种断奶食品，可供幼儿食用。产品不含肠道菌、霉菌及酵母等有害菌t 是一种 安全、价格便宜、营养丰富的食品。 8 ) 在印尼刺痒黎豆也可发酵成丹贝来制成一种快餐。研究表明，同大豆丹贝相比， 刺痒黎豆丹贝有更多的膳食纤维异黄酮总量和其苷元含量均有明显提高，但维生素e 会有所降低。它含有32 ，5 的蛋白、7 3 的脂肪、3 r o 的灰分、5 8 1 的碳水化合物和 9 i 的膳食纤维。 9 ) 椰肉经工业提取椰油后所遗留的残渣也可用少孢根霉发酵制成丹贝它很好地利 用了工业废料，并有宜人的口感。但如果椰肉的脂肪未提净，就会引起椰酵假单胞苗和 椰毒伯克霍尔德氏菌的滋生，它们会产生黄毒菌素和米酵菌酸两种毒紊，会使人体中毒。 不过研究表明如在发酵前基质中加入少量食盐，并将p h 值调至4 , 5 t 就会抑制这两种杂 菌的生长。 i o ) h i d e y u k i a 证实，在丹贝正常发酵2 0 h 后，厌氧通入氮气培养5 h ，则g a b a 的 含量会由正常发酵时的3 0 m g 1 0 0 9 升至1 5 0 0 m g 1 0 0 9 。y 一氨基丁酸( g a b a ) 是哺 l 动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质，具有促使精神安定、营养神经细胞等重 要的生理功能。g a b a 的大幅度增长提高了丹贝的保健功效，并拓展了其在保健品市场 的空间。 1 1 ) 在美国堪萨斯州，人们用当地生产的黑麦、大麦、燕麦及高梁等谷物同大豆混 合经少孢根霉发酵制成了丹贝。这种丹贝有非常好的外观和口味但是结块性不好，易 碎。 1 2 ) 少孢根霉和米根霉可以4 ：1 比例混合，并辅以弗氏柠檬酸菌发酵大豆制成丹贝。 因为米根霉更有效地降解大豆中的“胃涨气因子”并产生v ”v e 、v k 等脂溶性维生素 及其前体( 胡萝h 素等) ：而弗氏柠檬酸菌能显著提高丹贝中钴胺素的含量，井能产生硫 胺素、生物素等水溶性维生素，全面提高丹贝的营养价值。 1 4 本课题研究的目的及内容 1 4 1 研究目的 1 ) 明确丹贝主要营养成分的含量 2 ) 确定丹贝的食用安全性 1 4 2 研究内容 1 ) 在实验室试制丹贝 2 ) 测定丹贝含氮类营养成分的含量 3 ) 测定丹贝脂类成分的含量 4 ) 测定丹贝b 族维生素的含量 5 ) 对丹贝进行常规安全性检验 6 ) 对丹贝进行细菌学检验 2 材料与方法 2 1 实验材料： 2 1 1 实验原料 市售优质大豆；少孢根霉，菌株号c c t c c a f 9 6 0 0 4 ，购自武汉菌种保藏中心 2 1 2 实验试剂 2 0 种氨基酸标准样( 色谱纯，b d h 公司) ：六种标准脂肪酸( 色谱纯，s i g m a 公司) ； 维生素b l ( 生化试剂) ：维生素b 2 ( 生化试剂) ：维生素b 1 2 ( 生化试剂) ；甲醇( 色谱 纯) ：环磷酰胺( 上海华联制药有限公司产，批号0 2 1 1 0 4 ) ：秋水仙碱( 上海化学试剂采 购供应站进口分装，批号1 卜1 0 ) ；黄曲霉毒素b ( a f b ) 酶联免疫测试盒( 江苏无锡 微生物研究所制批号2 0 0 3 0 6 2 0 ) ：磺基水杨酸( a r ) ；无水n a 2 s 0 4 ( a r ) ：n a n ，( a r ) ： 敌克松( c r ) 2 1 3 试剂的配制 水合茚三酮显色液：1 0 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 、6 9 r d q 2 p 0 4 、0 5 9 茚三酮、o 3 9 果糖，以 蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 水合茚三酮稀释液：2 9 r d 0 3 、6 0 0 m l 蒸馏水、4 0 0 r a l 乙醇，混匀。 考马斯亮蓝溶液：称取o 1 9 考马斯亮蓝g - 2 5 0 ，溶入5 0 m l 无水乙醇中，再加入 1 0 0 m 1 8 5 磷酸，以蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 。 i b r 溶液：将6 6 北溶于5 0 0 m l 冰醋酸中，再加入1 5 m l 溴素，避光保存。 n a 2 s 2 0 3 溶液：取0 7 9 9 n a 2 s 2 0 3 溶于5 0 0 m l 蒸馏水中，再加入0 1 5 9 n a 2 c 0 3 2 i 4 培养基的配制 p d a 培养基：取2 0 0 9 马铃薯，去皮，切碎，水煮3 0 m i n ，加入2 0 9 葡萄糖及2 0 9 琼脂粉，加水定容至1 0 0 0 m l ，分装灭菌。 普通营养琼脂培养基：取3 9 牛肉膏、1 0 9 蛋白胨、5 9 n a c i 及2 0 9 琼脂粉，加水定 容至1 0 0 0 m l ，调p h 至74 7 6 ，分装，灭菌。 麦康凯培养基：取市售麦康凯培养基5 0 9 ，加水定容至1 0 0 0 m l ，调p h 至7 2 7 4 ， 分装，灭菌。 乳糖胆盐发酵管：取2 0 9 蛋白胨、5 9 胆盐、1 0 9 乳糖、0 0 4 9 1 0 0 m l 溴甲酚紫2 5 m l ， 定容至1 0 0 0 m l ，调p h 至7 2 7 4 ，分装，灭菌。 乳糖发酵管：除无胆盐外，其他同上。 2 1 5 实验器材 普通电子天平，j y 3 0 0 2 型，3 0 0 9 1 0 m g 4 高压灭菌锅，y x o s g4 6 2 8 0 型北京医疗器械一厂 恒温培养箱h h b1 1 ，上海跃进医疗器械一厂 分光光度计，7 2 1 型上海第三分析仪器厂 半微量凯氏定氮设备，龙科a 型，哈尔滨药用玻璃二厂 普通台式离心机，l d 4 2 北京医用离心机厂 氨基酸分析仪，8 3 5 型日本岛津公司 超速离心机，g s 1 5 r 型美国b e c k m a n 公司 索氏抽提器，2 5 0 m 1 分析天平，t g 3 2 8 a 型，2 0 0 9 0 i m g ，上海长江科学仪器厂 电热干燥箱，h g x 型，连云港医疗器械厂 r 匾温水浴锅。h h s 型，上海医疗器械五厂 气相色谱仪，s p 6 8 0 0 a 型，山东鲁南瑞虹化工仪器公司 高效液相色谱仪，z - 3 1 5 型，瑞典w a t e r s 公司 微孔滤膜，孔径o 4 5un l 无菌超净台，w c j 1 b ，苏州净化设备厂 生物显微镜，y x q s g 型，日本o l y m p u s 公司 2 1 6 其它 小白鼠，昆明种，体重1 8 - 2 2 9 ，雌雄兼用 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型( h i s 一) 站毒理室提供 黑龙江中医药大学实验动物中心提供 9 7 、9 8 、1 0 0 、1 0 2 ，黑龙省省卫生防疫 野生型鼠伤寒沙门氏菌株，黑龙江省微生物研究所提供 2 2 实验步骤 2 2 1 丹贝的试制 2 2 1 1 基本工艺流程 精选大豆浸泡大豆蒸煮一酸化基质接入菌种- 分装一恒温培养 2 2 1 2 发酵菌种的制备 调取少孢根霉孢子在p d a 培养基平板上划线培养( 3 t c ) ，待4 5 天后平扳上的菌 丝长满孢子时以生理盐水将孢子冲下，接种大豆按上述基本流程制成首批丹贝。再将 其磨碎，于4 5 c 温箱内烘至原重量的一半( 大约4 6 小时) ，即为本实验所用的发酵菌 种。 2 2 1 3 发酵基质预处理 精选大豆，在室温( 1 8 2 2 c ) 下以三倍清水浸泡1 8 2 4 h ，重量增加为原来的2 2 2 4 倍，浸泡前清水以乳酸调p h 至4 5 。大豆泡好后，以0 0 8 m p 高压蒸煮2 0 r a i n 以使其 软化。 2 2 1 4 基质乳酸加入方式、用量及发酵温度的确定 火豆蕉煮后除去水分，再以乳酸酸化。接入少量菌种后，分袈容器中，封口恒温 培养。酸化基质方式为：在蒸煮后的大豆中直接加湿重0 2 、08 、2 和4 乳酸： 蒸煮前火豆不川p h 4 5 的乳酸液浸泡，代之以p h 4 0 、p h 35 、p h 3 0 和p h 2 5 乳酸液 浸泡。每种酸化处理采用的相应发酵温度为3 0 c ，3 6 c 和4 】。晟后以发酵后舶效果为 判定依据，确定乳酸加入方式、用量和发酵温度。 2 2 1 5 丹贝发酵对问的初步确定 跟踪观察丹贝各发酵时段的气味、质地、菌丝性状等感观状态( 0 h 一7 2 h ) ，初步确定 丹贝发酵敬果最佳的时间范围，为最终发酵时间的确定提供依据。 2 2 2 含氮类营养成分含量的检测 2 2 2 1 总氮量的测定 将丹贝发酵各时段的样品磨碎后，直接以凯氏定氮法测定总氯。 2 2 2 2 非蛋白氮含量的测定 取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 h 样品各2 9 。磨碎以1 0 醋酸水溶液1 0 m l 浸泡沸水 浴i o m i n 提取含氮物。而后4 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，取上清。余下的沉淀再重复提取两次。 最后合并上清液，定容5 0 m l 即为定氮待测液，以凯氏定氮法测定非蛋白氮( n p n ) 。 2 2 2 3o 氮基氮含量的测定 称取0 1 0 7 2 9 甘氨酸，以蒸馏水定容至1 0 0 m 1 再取l m l 用水稀释至1 0 0 m 1 每毫升 此溶液相当予2 ”go 氪基氮。再以此溶液配成a 一氮基氦浓度为0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 、 1 2 、14 、16 、1 8 、2 0ug mj 的梯度溶液，分别吸取2 m l 溶液按下述方法测定其o d 5 7 0 。 以浓度为横坐标、o d m 为纵坐标，绘制标准曲线。 按2 2 2 2 步骤制得定氮待测液作为样品提取液，吸取2 m l 提取液至试管，再加入 1 m i 茚三酮显色液和5 m l 稀释液，沸水浴1 6 m i n ，取出到清水中室温冷却1 6 r a i n ，上分光 光度计测量其o d 。然后到标准曲线上寻找相应的a 氨基氮浓度，最后乘以提取液体 积得到样品a 氮基氮含量。 2 2 2 4 多肽氮的推算 多肽氮t 非蛋白氮n 氮基氮 2 2 2 5 水溶性氮指数的测定 取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 h 样品各2 9 ，磨碎，以1 0 m 蒸馏水浸泡搅拌1 0 m i n 提 取含氮物。而后以4 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，取上清。沉楗再重复提取两次。最后合并上清 液。定容至5 0 m l 即为定氮待测液，以凯氏定氮法测定水溶性氮量。 永溶性氦指数( n s i ) 9 红水溶性氪量样品总氮量1 0 0 2 2 2 6 水溶性蛋白含量的测定 称取0 1 9 牛血清蛋白溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，以此配成浓度为0 1 、0 2 、0 3 、0 4 、 o5 、0 6 、0 7 、0 8 、0 9 、1 0 m g m l 的梯度溶液，分别吸取0 1 m l 溶液按下述方法测定其 o d 。以浓度为横坐标、o d 为纵坐标，绘制标准曲线 按2 2 2 5 步骤制得水溶性氮定氮待测液作为样品提取液，吸取o 1 m ! 提取液至5 m l 考马斯亮蓝溶液中，摇匀，两分钟后上分光光度计测量其0 d 5 9 5 。然后到标准曲线上寻 1 6 找相应的蛋白浓度，最后乘以提取液体积，得到样品蛋白含量。 2 2 2 7 样品醇溶性蛋白含量的测定 以7 0 乙醇代替水浸泡样品，提取条件为8 0 水浴1 0 m i n 其余同2 2 2 6 步骤。 3 2 2 8 游离氨基酸的分析 取2 9 丹贝发酵各时段样品以3 磺基水杨酸溶液浸泡，搅拌提取1 0 分钟。1 0 0 0 0 r p m 超速离心3 0 r a i n ，取上清，用去离子水定容至2 5 m l 。以0 4 5 1 , 1m 滤膜过滤，取2 0u1 滤 液，以氨基酸分析仪分析其氨基酸种类、含量。 3 2 2 9 蛋白酶活力测定 分别取发酵0 h ，2 2 h 。2 6 h ，3 0 h 。3 4 h ，3 8 h ，4 2 h 的丹贝样品1 9 磨碎，放入三角瓶 加5 0 m l 水，摇匀，此为粗酶液。再取两只三角瓶，分别加入5 m l 同一样品的粗酶液和 5 m l o 5 蛋白胨溶液。将其中一只三角瓶进行沸水浴i o m i n ，使蛋白酶灭活，此为空白 样。向所有装有粗酶液和蛋白胨的三角瓶加入1 m i 甲苯，再放入3 7 c 温箱，静置温育 1i h 。取出定容至l o o m l 取l m l 以水合茚三酮法测定a 氮基氮浓度。本实验中的酶活力 定义为每克样品的蛋白酶在1 h 内水解出的a 氨基氮m g 数。 酶活力= ( “t 一“2 ) x1 0 0 l o 1 0 0 0 h n ：样品液中最后的a 氮基氮浓度( ug r n l ) ；n 2 ：空白液中晟后的a 氮基氮浓度( u g r o d ：1 0 0 ：a 氨基氮待测液的体积( m 1 ) ； 1 0 i 粗酶液( 5 0 m 1 ) 与实测液( 5 m 1 ) 体积之比：1 0 0 0 ：ug m l 与m g l m l 的换算系数；h ：3 7 温育时间( h ) 3 2 2 1 0 含氮类营养成分增长率的比较 根据显著性分析比较发酵2 4 h 3 0 h 和3 0 h 4 8 h 两个时段含氮类营养成分各指标的 增长率，以确定哪一时段内丹贝含氮类营养成分增长更为显著。增长率分别为( a 3 0 a 2 4 ) ( 3 0 一2 4 ) 、( a 4 8 一a 3 0 ) ( 4 8 - - 3 0 ) 。3 0 、2 4 、4 8 均为发酵时间a 3 0 、a 2 4 、 a 4 8 分别为3 0 h 、2 4 h 、4 8 h 时含氮类营养成分各指标的数值。( a 3 0 - - a 2 4 ) 为2 4 - 3 0 h 时段各指标的增幅，( a 4 8 - - a 3 0 ) 为3 0 - - 4 8 h 时段各指标的增幅。 2 2 3 脂类营养成分的测定 2 2 3 1 脂类总量的测定 取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 h 样品各2 9 ，磨碎，连同滤纸于1 0 5 ( 5 ) 烘箱内烘干 至恒重，取出过s o 目筛( 利于脱脂) ，取3 - , - 4 9 干粉。以分析天平准确称重t 计为m l 以滤纸包裹样品干耪，准确称滤纸包重，计为m 2 。置于索氏抽提器内以乙醚抽提6 8 小时，取出于5 0 c 下晾干乙醚至恒重( 温度过商则乙醚易燃) ，准确称重，计为m 3 。 脂类总含量= ( m 2 一m 3 ) m l 1 0 0 。其中脂类总质量为m 2 - - m 3 2 2 3 2 酸价的测定 以上述索氏抽提法制得( 1 2 0 m 1 ) 丹贝脂肪乙醚溶液，；b d ) , , i g l 体积无水乙醇再加入 4 5 m l 饱和n a c i 水溶液滴入2 3 滴酚酞作指示剂，用0 0 5 m o l l k o h 滴定。观察盐 水层的颜色由无色变为红色时，记录所用k o h 体积。 “ 酸价= v x c x 5 6 ，1 m v 、c ：所用k o h 溶液的体积、浓度( m l 、m o l l ) ： 5 61 ：k o h 的摩尔质量； m ： 东北农业大学农学硕士学位论文 所测样品的脂类质量( g ) ： 2 2 3 3 碘价的测定 以索氏抽提法制得( 1 0 2 0 m 1 ) 丹贝脂肪乙醚溶液，加入2 5 m l l b r 溶液，置于暗处反应 4 0 r a i n 。加入1 0 m l l 5 k i 水溶液和5 0 m l 蒸馏水用0 0 i m o l l n a 2 s 2 0 ) 滴定，当乙醚溶 液由紫色变为黄色时，加入l 淀粉溶液约l m l 溶液变黑，然后继续滴定至白色，记 录终点时所用的n a 2 s 2 0 3 溶液体积。 碘价= ( v l v z ) x c 1 2 9 8 m v l ：滴定空向( 纯无水乙醚) 时所用n a 2 s 2 0 3 溶液体积( m 1 )v 2 ：滴定脂肪乙醚 溶液时所用n a 2 s 2 0 3 溶液体积( m 1 )c ：n a 2 s 2 0 3 溶液的浓度( m o l l )m ：所测样品 的脂类质量( g ) 1 2 9 8 ：折算系数 2 2 3 4 游离脂肪酸的分析 1 ) 提取：取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 1 a 样品各2 9 ，磨碎，烘干至恒重。过8 0 目筛， 分别称取2 9 ，加入2 0 m l 石油醚，振荡提取1 0 m i n ，4 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，收集上清。沉 淀再加入石油醚提取两次，合并三次的提取液。样品中的脂肪被提取到石油醚中。向提 取液中加入o 0 0 5 m o l l 的n a 2 c 0 3 溶液1 0 m l ，转入分液漏斗中摇匀静止分层后，收集 r 层水相上层以同样方法再提取两次，合并三次水相溶液。石油醚中的游离脂肪酸变 成脂肪酸钠，进入水层。以o 1 m o l l h c l 调p h 值至3 ，使脂肪酸钠重新变回游离脂肪酸。 再转入分液漏斗，加入1 0 m l 石油醚，分层后收集上层溶液下层以同样方法再提取两 次，合并三次石油醚溶液，减压浓缩后以各甲脂化。 2 ) 甲脂化：向装有脂肪酸样品的试管中加入5 m l l m o l l 的k o h 甲酵溶液，充n 2 后密封，置于7 5 水浴中酯化4 0 r a i n ，冷却后加入石油醚提取脂肪酸甲酯。提取液转移 到5 m l 锥形具带孔塞离心管中用n 2 吹干后加入正已烷定容即可供色谱分析。 3 ) 气相色谱分析游离脂肪酸：色谱柱：不锈钢填充柱( 2 m 3 m m ) 担体为洛母 沙伯，填充】6 的d e g s ；温度：柱温1 9 0 ( 2 ，汽化室2 5 0 c ，检测器2 5 0 ； 载气：高纯氮气，流速为3 0 m l m i n ；进样量：2 “l ；衰减；4 ； 灵敏度：4 。 4 ) 标准溶液的制备将软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸的标 准甲脂化样品各1 0 m g 分别用正己烷定容为5 m l ，得到2 m m l 的六种标准溶液。 2 2 3 5 脂类营养成分增长率的比较 根据显著性分析比较发酵2 4 h 3 0 h 和3 0 h 4 8 h 两个时段脂类各指标的增长率，以 确定哪一时段内丹贝脂类营养成分增长更为显著。增长率分别为( a 3 0 - - a 2 4 ) ( 3 0 - - 2 4 ) 、( a 4 8 - - a 3 0 ) ( 4 8 - - 3 0 ) ，3 0 、2 4 、4 8 均为发酵时间，a 3 0 、a 2 4 、a 4 8 分别 为3 0 h 、2 4 h 、4 8 h 时脂类各指标的数值。( a 3 0 - - a 2 4 ) 为2 4 - 一3 0 h 时段各指标的增幅，( a 4 8 一a 3 0 ) 为3 0 - - 4 8 h 时段各指标的增幅。 2 2 4 部分b 族维生素的测定 2 2 4 1 维生素b l 、b 2 、b 1 2 含量的测定 i ) 维生素b l 、b 2 的提取：取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 h 样品各2 9 ，磨碎，7 0 烘 干至恒重。取2 91 - 三角瓶，加5 0 m 1 01 m o l l h c l ，于高压锅内1 2 0 提取3 0 m i n 取出 后经4 0 0 0 r p m 离，e l , 1 0 m i n 经普通滤纸过滤，定容至5 0 m l 。取1 0 m l 滤液用o 4 5l am 滤 膜过滤。滤液上液相色谱待测。 2 ) 维生素b 】o 的提取：取发酵o h 、2 4 h 、3 0 h 和4 8 h 样品各2 9 ，磨碎，7 0 c 烘干。 取2 0 9 置于三角瓶，加5 0 m l 纯净水，7 0 水浴3 0 r a i n 。取出后经4 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ， 经普通滤纸过滤，定容至5 0 m l 。加入滤液一半重量的无水n a 2 s o d ( 2 5 9 ) ，n a 2 s o d 吸水 形成结晶后过滤，再向滤液加入其一半重量的无水n a 2 s o 。，直至滤液被浓缩至i m l 为止， 此时b 1 2 被浓缩5 0 倍。再用0 4 5 um 滤膜过滤待测。 3 ) 液相色谱法测定三种维生素：色谱柱：b o u d p u k ，c ，1 8 ( 3 9 m m x 2 5 0 m m ) ： 流动相：h a c - n a a c 缓冲液( p h 4 ，1 8 ) ，1 0 甲醇一水，o 0 2 三乙胺；流速：l m l m i n ： 检测器：u v 2 5 4 n m ( w a t e r s 2 4 8 7 紫外监测器) ：进样攫：2 0ul ：灵敏度：0 5 注：上述流动相条件只是供检测维生素b 1 用，维生素b 2 、b 1 2 检测时，流动相的甲醇一 水比例分别为2 5 和2 8 ，色谱的其他条件均不变。所有流动相使用前需经o4 5um 滤 膜超滤。 4 ) 标准溶液的制各：分别将1 0 m g 的三种标准维生素用去离子水定容至5 m l ，各 得到2 m g m l 的标准溶液。 2 2 4 2 维生素增长率的比较 根据显著性分析比较发酵2 4 h 3 0 h 和3 0 h 4 8 h 两个时段各类维生素的增长率以 确定哪一时段内丹贝维生素增长更为显著。增长率分别为( a 3 0 - - a 2 4 ) ( 3 0 - - 2 4 ) 、 ( a 4 8 - - a 3 0 ) ( 4 8 - - 3 0 ) 。3 0 、2 4 、4 8 均为发酵时间，a 3 0 、a 2 4 、a 4 8 分别为3 0 h 、 2 4 h 、4 8 h 时各维生素的含量。( a 3 0 a 2 4 ) 为2 4 3 0 h 时段含量的增幅，( a 4 8 - - a 3 0 ) 为3 0 4 8 h 时段含量的增幅。 2 2 5 常规安全性检验 2 2 5 1 急性经口实验 收小白鼠5 0 只，雌雄各半，随机分成5 个剂量组，相邻剂量按等差级数设计。分别 以不同剂量发酵3 0 h ( 下同) 的丹贝液灌胃7 天，观察有无毒性反应并求出半数致死量 l d 5 d 。 2 2 5 2 骨髓细胞微核实验 取小白鼠5 0 只，雌雄各半，随机分成5 组。按s c h m i d 氏法阴性对照组i 、1 1 分 别连续以未发酵大豆液( 0 3 9 k g 、0 5 9 k g ) 灌胃7 天实验1 、2 组连续以丹贝液( 0 3 9 k g ， 0 5 9 k g ) 灌胃7 天，阳性对照组按4 0 m g k g 给小鼠腹腔注射环磷酰胺( c p ) ，间隔2 4 h 后再注射同样剂量c p ，6 h 后5 组小鼠均用断髓法处死取出胸骨骨髓，常规方法制片， 并计算微核干分率( m n ) 。 2 2 5 3 精母细胞染色体畸变实验 实验动物的品种、分组和处理方法同骨髓细胞微核实验。按a d l e r 氏法，处死小鼠前 3 h 各组均腹腔注射秋水仙碱( 4 m g k g ) ，常规制各染色体标本，g i e m s a 染色，井计算精 母细胞染色体畸变率( c a ) 。 2 2 5 4 精子畸变实验 9 东北农业大学农学硕士学位论文 i i i i 自! ! ! ! ! ! ! = ! ! ! 自! = = = = ! ! ! ! ! ! g ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! = 除所用小自鼠全部为雄性外，实验动物的品种、分组和处理方法均同骨髓细胞微核 实验，取出小鼠附皋，常规法计算精子畸变率。 2 2 5 5 a m e s 实验 按a m e s 实验点试法。以鼠伤寒沙门氏茁h i s 一9 8 、9 7 、1 0 0 、1 0 2 及其野生型为测试 菌株用前需对h i s 一沙门氏菌进行基因型鉴定。以0 5 n a n 3 、o 5 敌克松为诱变荆； 以1 0 丹贝液为待测样品，以1 0 未发酵大豆样品阴性对照。实验作重复数为3 ，测定 丹贝有无致突变作用。 2 2 5 6 a f b i 含量的测定 取发酵、未发酵样品各5 9 磨碎后置于三角瓶，加2 0 m l 甲酵一水( 1 ：i ) 和2 0 m l 正己炕，振荡提取1 0 m i n 。提取液过滤后移八分液漏斗，放下层于三角瓶，上层用5 m l 甲醇再提取一次，合并提取液此为a f b l 待测液。然后以a f b 。检测试剂盒测定其含量。 2 2 5 7 砷、铅的测定 参照g b 5 0 0 9 1 9 9 6 1 1 、g b 5 0 0 9 1 9 9 6 1 2 ，测定丹贝和未发酵样品的砷、铅含量。 2 2 6 细菌学检测 2 2 6 1 p h 值的测定 以常规方法制丹贝，在接入根霉后连同对照( 未接菌大豆，下同) 放入3 7 温箱培 养，以精密p h 试纸测定发酵0 h 、2 4 h 、3 0 h 、3 6 h 、4 2 h 、4 8 h 的丹贝p h 值。由于乳酸 渗入豆瓣需要一定时间，所以本实验是从在温箱放置5 h 后，乳酸完全渗入豆瓣时开始测 定p h 值的。 2 2 6 2 总菌数的测定 以常规方法制丹贝在接入根霉后连同对照放入3 7 温箱培养。在0 h 、2 4 h 、3 0 h 、 3 6 h 、4 2 h 、4 8 h 时各取出i g 样品磨碎，以5 0 m i 无菌生理盐水稀释。取l m l 菌液分别 稀释成1 0 一、1 0 、1 0 - 4 三个梯度，以倾注法在普通营养琼脂培养基上制成含菌平板， 3 7 培养2 4 h 后进行菌落计数然后按常规方法计算其总菌数。 2 2 6 3 大肠菌群最近似数的测定 以常规方法制丹贝，在接入根霉后连同对照放入3 7 温箱培养。o h 、2 4 h 、3 0 h 、3 6 h 、 4 2 h 、4 8 h 时各取出l g 样品，磨碎，以1 0 m l 无菌生理盐水稀释。取l m l 菌液分别稀释成 l 、1 0 、1 0 2 三个梯度每个稀释梯度各取i m l 分别到三只乳糖胆盐发酵管3 7 c 培 养2 4 h 。不变色的为阴性，再从由紫变黄的发酵管取0 1 m l 菌液涂布麦康凯培养基，3 7 培养2 4 h 后取半个红色菌落做革兰氏染色并镜检，余下部分再接入乳糖发酵管，若3 7 培养2 4 h 后仍为黄色，镜检为阴性短杆菌则判定为阳性。根据 -1 92 1 91 1 8 ； 01 0 2 03 04 0 5 0 发酵时间( h ) 图3 - 6 丹贝发酵期间脂类总量的变化 f i 9 3 6t h ec h a n g eo f t o t a ll i p i d sc o n t e n to f t e m p ed u r i n g i tw a sf e r m e n t e d 该图3 - 6 说明，在发酵过程中脂类总置的变化不大只是由发酵前的2 0 2 减到发 酵3 0 h 的1 9 1 ，此后保持稳定。说明根霉生长会使基质中的脂类减少，有资料证实这 是由于根霉生长所需的碳源主要是大豆中的脂肪，丹贝中脂类的变化规律也在定程度 上表明了少孢根霉的生长状态。因为大豆脂类中的胆固醇含量极低，并且其中的脂肪不 饱和程度较高，因此它具有非常高的保健功效。由于丹贝发酵过程中只有少量脂类被利 用，这使得大豆脂肪的保健作用得以保全。 3 3 2 酸价的确定 酸价反映了食品中游离脂肪酸的多少。图3 7 说明发酵后酸价显著提高，至3 0 h 时 达到2 1 ，0 2 ，较发酵前提高了37 倍。游离脂肪酸主要是根霉利用、水解脂肪时的产物， 它们的增多可以提高脂肪的水溶性，而且脂肪水解的产物甘油一、二脂还会起到乳化脂 肪的作用，这些都会使丹贝脂肪更加易于人体吸收使其营养价值得到更充分的利用。 而且丹贝脂肪酸价虽有一定提高，但是丹贝中含有多种抗氧化物质( 主要为异黄酮) 可 避免其发生严重酸败，所以还不会影响到其保藏效果。 3 0 2 5 2 0 藩s 1 0 5 0 一 0l o 发酵时间(