（计算数学专业论文）基于生物信息学方法预测microrna的研究.pdf

2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 摘要 近年来，发现一类新的长约2 1 2 5 n t 的非编码内源性小分子r n a 叫i c r o r n a ( 简称m i r n a ) 。m i r n a 的一个特点是它的前体形成茎环结构， 成熟体在茎环结构的- - f 1 4 上，成熟体序列内不能包含大的内环和突环，特别是 不能包含大的不对称环。m i r n a 通过与靶基因m r n a 的特定位点互补配对达 到对靶基因的降解或翻译抑制，从而参与基因的表达调控。m i r n a 通常位于基 因间隔区( i n t e r g e n i er e g i o n ) ，也有一部分来源于编码区的内含子。一些m i r n a 的基因结构和功能在进化中呈现高度的保守性，但是病毒m i r n a 和其他一些 真核生物的m i r n a 并不具有这种特点。 由于m i r n a 对生命体具有非常重要的调控功能，而且近年来发现，m i r n a 与人类疾病的发生有着密切的联系，因此寻找新的m i r n a 是生命科学领域的 一大热点。0 4 年以来，病毒m i r n a 又成为研究的重点。寻找m i r n a 基因的方 法有实验方法和生物信息学方法，两种方法结合使用，才能准确地找到m i r n a 基因。到目前为止，m i r b a s e 上公布的m i r n a 已有5 3 9 5 种，其中病毒的m i r n a 有1 3 0 种。然而不同生物中的仍有大量的m i r n a 基因尚待鉴定，生物信息学 分析手段为发现新的m i r n a 基因提供了有效的方法。从2 0 0 3 年出现第一个 m i r n a 的预测工具m i r s c a n 后，出现了很多计算预测m i r n a 的方法，根据其 本质可以分为五类：同源片段搜索方法、基于比较基因组学的预测方法、基于 序列和结构特征打分的预测方法、结合作用靶标的预测方法和机器学习方法。 由于不同病毒的m i r n a 之间序列相似性极低，不同物种m i r n a 的特点又 不尽相同，针对这一问题，我们开发了一个预测与探寻m i r n a 基因的计算机 软件m i r f i l t e r 。m i r f i l t e r 是由c 撑语言编码，文章详细地介绍了它的设计流程， 重点讲述了实现预测的三个重要算法：发夹结构判断算法、筛选成熟体算法和 c d s 字段搜索算法。并详尽地讲解了它的使用方法。我们用两种病毒的m i r n a 检测软件的精度，结果标明m i r f i l t e r 精度较高，假阳性控制较好。 关键词：m i r n a ，茎环结构，病毒m i r n a ，生物信息学特征，计算预测方法 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t r e c e n t l ym i c r o r n a s ( m i r n a s ) ，ac l a s so f2 1 2 5 n tn o n - c o d i n gs m a l lr n a s ， h a v eb e e nf o u n da n de x h i b i tu n i q u ep r o p e r t i e s f o re x a m p l e , m i r n ap r e c u r s o r s g e n e r a l l yf o r ms t e m l o o ps t r u c t u r e m a t u r em i r n a sd e r i v ef o r mo n es i d eo fs t e m r e g i o na n dc a n n o tc o n t a i nb i gi n t e r i o rl o o po rb u l g el o o p ，e s p e c i a l l yb i ga s y m m e t r i c i n t e r i o rl o o p b yb i n d i n gt os p e c i f i cr e g i o no ft a r g e tm r n a sv i as t r e t c h e so f s e q u e n c ec o m p l e m e n t a r i t y , m i r n a sd e g r a d eo ri n h i b i tt r a n s l a t i n gt a g e tm r n a s ， c o n s e q u e n t l yr e g u l a t et h eg e n ee x p r e s s i o n m i r n ag e n e sa l eg e n e r a l l yl o c a t e da t i n t e r g e n i cr e g i o no ri n t r o nr e g i o n 1 0 t so fm i r n a s s t r u c t u r ea n df u n c t i o na r eh i 曲 c o n s e r v e di ne v o l u t i o n ,w h i l em i r n a se n c o d e di nv i r u sa n ds o m eo n e si n e u k a r y o t e sa r en o tc o n s e r v e d m i r n a sp l a yi m p o r t a n tr e g u l a t o r yr o l e si nl i f e a n dr e c e n t l yi n v e s t i g a t i o n s e x h i b i ti n t i m a t er e l a t i o n sb e t w e e nm i r n a sa n dh u m a nd i s e a s e s t h e r e f o r e ，l o o k i n g f o rn e wm i r n ab e c o m eag r e a tf o c u so fb i o l o g i c a lf i e l d f u r t h e r , s i n c e2 0 0 4 ， r e s e a r c h e sh a v eg i v e nm i r n a se n c o d e di nv i r u sm u c ha t t e n ，t i o n t h e r ea r et w o a p p r o a c h e sb a s e do ne x p e r i m e n t sa n db i o i n f o r m a t i c st os e a r c hm i r n ag e n e s t h e y a r eu s u a l l yc o m b i n e dt ow o r kp r o p e r l yb e c a u s ee i t h e ro ft h e ms i n g l yi sn o ta d e q u a t e t of i n dr n i r n a sg e n e sm o r ea c c u r a t e l y u pt on o w ，t h e r ea r e5 3 9 5k i n d so fm i r n a s a n n o u n c e do nm i r b a s e ，i n c l u d i n gm o r et h a n13 0k i n d so fr n i r n ae n c o d e di nv i r u s h o w e v e r , al a r g en u m b e ro fm i r n ag e n e sh a v en o tb e e n i d e n t i f i e d y e t b i o i n f o r m a t i c sa n a l y t i ch a sp r o v i d e daw a yt of i n dn e wm i r n a sg e n e se f f e c t i v e l y s i n c et h ef i r s tc o m p u t a t i o n a lt o o lm i r s c a na p p e a r i n gi n2 0 0 3 ，c o m p u t a t i o n a l m e t h o d st op r e d i c tm i r n aa r ed e v e l o p i n g 1 1 1 e yc a nb ed i v i d e di n t o5c a t e g o r i e s e s s e n t i a l l y , i n c l u d i n gh o m o l o g o u sf r a g m e n ts e a r c hm e t h o d , m e t h o db a s e do n c o m p a r a t i v eg e n o m i c s ，m e t h o db a s e do ns c o r i n gt h ef e a t u r e so fs e q u e n c ea n d s t r u c t u r e ，b i n d i n gt a r g e t sm e t h o da n dm a c h i n el e a r n i n gm e t h o d d u et ol i t t l es i m i l a r i t yb e t w e e ns e q u e n c e so fm i r n a se n c o d e di nd i f f e r e n t v i r u s e sa n dd i s t i n c tf e a t u r e so fm i r n a si nd i f f e r e n ts p e c i e s ，w eh a v ed e v e l o p e da c o m p l e t ea u t o m a t e dp r o c e d u r en a m e dm i r f i l t e rt op r e d i c ta n ds e a r c hf o rm i r n a s 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 t h eo v e r a l ld e s i g np r o g r a m m eo fm i r f i l t e rc o d i n gb yc 群i se l a b o r a t e di nd e t a i la n d t h r e ei m p o r t a n ta l g o r i t h m sa l ee m p h a s i z e d ：s t e m - l o o ps t r u c t u r ej u d g e m e n ta l g o r i t h m ， f i l t e r i n gc a n d i d a t em i r n aa l g o r i t h ma n ds e a r c h i n gc d sa l g o r i t h m t h e nw e d e t a i l 0 1 1i t su s e w h e nu s i n gm i r n a se n c o d e di nv i r u s ，d m e l a n o g a s t e ra n dc e l e g a n st o t e s tm i r f i l t e r sp r e d i c t i o na c c u r a c y , r e s u l t sh a v ep r o v e dt h a tt h ef a l s ep o s i t i v er a t e w a sl o wa n dm i r f i l e rp o s s e s s e sh i 【g ha c c u r a c y k e yw o r d s ：m i r n a , s t e m - l o o ps t r u c t u r e ，m i r n a e n c o d e di nv i r u s ， b i o l o g i c a lf e a t u r e s ，c o m p u t a t i o n a lp r e d i c t i o nm e t h o d 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表 或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本论文使用授权说明 期：兰! ! 步：受：， 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，u p 学 校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可 以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：遂堂杰导师签名趁 日期：趔：乡r 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 第一章绪论 无论从结构还是生命活动看，生命是一个具有严密的组织和高度的秩序性的 系统，而d n a r n a - 蛋白质秩序是生命有序的基础与核心。生命系统具有新陈 代谢( 生物体都在与外界不断进行物质和能量交换的状态) 、生长( 生物在其新 陈代谢的过程中不断地扩展着自己) 、稳定性( 生物对环境有应激能力) 、时向性 ( 历史上生物表现出明确的不断演变和进化的趋势) 等特征【1 1 。生命科学与人类 的生产生活有着密切的关系，社会的可持续发展对生命科学寄予了很大希望。生 物信息学的研究是从理论上认识生物本质的必要途径，通过生物信息学研究和探 索，可以更为全面和深刻地认识生物科学中本质问题，了解生物分子信息的组织 和结构，破译基因组信息，阐明生物信息之间的关系 2 1 。 1 1 生物信息学简介 1 1 1 生物信息学的发展历史 早在2 0 世纪5 0 年代，生物信息学就已经开始孕育，1 9 5 6 年在美国田纳西 州的g a t l i n b u r g 召开了首次“生物学中的信息理论研讨会。在2 0 世纪6 0 年代， 一些计算生物学家开始进行相关研究，虽然当时没有具体地提出生物信息学概 念，但是做了很多生物信息搜集和分析方面的工作。在这个时期，生物大分子携 带信息成为分子生物学的重要理论，生物分子信息在概念上将计算生物学和计算 机科学联系起来。大量的生物分子序列成为丰富的信息源，科学家们开始应用计 算方法分析这些信息。19 6 2 年，z u c h e r k a n d l 和p a u l i n g 研究了序列变化与进化之 间的关系，开创了一个新的领域一分子进化。1 9 6 7 年，d a y h o f f 研制出蛋白质 序列图集，该图集后来演变为著名的蛋白质信息源p i r 。2 0 世纪6 0 年代是生物 信息学形成雏形的阶段。 一般认为，生物信息学的真正开端是2 0 世纪7 0 年代从7 0 年代到8 0 年代初 期，随着生物化学技术的发展，产生出许多生物分子序列数据，而在这个阶段数 学统计方法和计算机技术都得到较快的发展，于是促使一部分计算机科学家应用 计算机技术解决生物学问题，特别是与生物分子序列相关的问题。他们开始研究 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 生物分子序列，研究如何根据序列推测结构和功能，生物信息学开始崭露头角。 2 0 世纪8 0 年代以后，出现了一批生物信息服务机构和生物信息数据库。随 后科学家们开始大规模的基因组研究，2 0 世纪9 0 年代后，生物信息学在人类基 因组计划的促动之下迅速发展【2 】。 1 1 2 什么是生物信息学 生物信息学是8 0 年代末随着人类基因组计划的启动而兴起的- i - j 新兴的交 叉学科。它涉及生物学、数学、计算机科学和工程学等学科，依赖于计算机科学、 工程学和应用数学的基础，研究的材料是生物学的数据，进行研究所采用的方法 则是从各种计算技术衍生出来的。广义上讲，生物信息学从事对生物信息的获取、 加工、储存、分配、分析和释读，并综合运用数学、计算机科学和生物学工具， 以达到理解数据中的生物学含义的目标。生物信息学具有三方面的科学基础：发 达的、复杂的、可相互交流的数据库；强有力的创新算法和软件；自动化的大规 模高通量的生物学研究方法与平台技术【3 】。作为一门交叉学科，生物信息学的发 展依赖于计算机科学科技和生物技术的发展，而生物信息学的研究成果又促进了 生物学特别是分子生物学的发展。 1 1 3 生物信息学的意义 生物信息学的出现改变了生物学的研究方式。传统的生物学是- - i - j 实验科 学，传统的分子生物学实验往往是集中精力研究一个基因、一条代谢路径，手工 分析完全能够胜任。然而，随着分子生物学技术的发展，已经出现一些高通量的 试验方法，如基因芯片，利用基因芯片一次可以获取上万个基因的表达数据。生 物学已经从一次只分析一个生物分子的时代跳跃到同时分析成千上万个生物分 子的时代，生物信息学必然要介入生物学研究和实验。再者，从生物分子数据本 身来看，各种数据之间存在着密切的关系，如d n a 序列与蛋白质序列、基因突 变与疾病等，这些关系反映了生物学的规律。但是，这些关系可能是非常复杂 的，是我们未知的，是简单的多元统计方法难以分析的。对于这些复杂的关系， 必须运用现代信息学的方法去分析，去研究。因而，随着分子生物学研究的深入， 必然需要生物信息学。另外，现在全世界每天都会产生大量的核酸和蛋白质序列 数据，不可能用实验的方法去详细研究每一条序列，必须首先进行信息处理和分 析，去粗取精，去伪存真。通过预处理，发现有用的线索，在此基础上进行有针 2 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 对性、有明确目的的生物学实验。因而，生物信息学在指导实验、精心涉及实验 方面将会发挥重要的作用。 生物信息学在医学上也有重要的意义。通过生物信息学分析，可以了解基因 与疾病的关系，了解疾病产生的机理，为疾病的诊断和治疗提供依据。研究生物 分子结构与功能的关系将是研制新药的基础，可以帮助确定新药作用的目标和作 用的方式，从而为涉及新药提供依据，揭示人类及重要动植物种类的基因的信息， 继而开展生物大分子结构模拟和药物设计，是当今国际上正在迅速发展的自然科 学领域最重大的课题之一。这方面的研究不仅对认识生物的起源及对认识生物遗 传、发育与进化的本质有重要意义，而且将为人类疾病的科学诊断和合理治疗开 辟全新的途径，还可为动植物的物种改良提供坚实的理论基础【4 ，5 】。 1 2m i e r o r n a ( 微r n a ) 1 2 1 m i r n a 的发现 r n a 一度被认为是d n a 和蛋白质的过渡，但近年来越来越多的研究表明， r n a 在生命进程中的作用比我们想象得更为重要。r n a i ( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a 干扰) 的发现使人们对r n a 调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以 简化或替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具。2 0 ( k 卜2 0 0 3 年，r n a i 先 后四次被科学和自然杂志评为重大科技突破，r n a 研究的突破性进展， 是生物医学领域近2 0 年来，可与h g p ( 人类基因组计划) 相提并论的最重大成 果之一。随着对小分子r n a 研究的深入，人们发现，小分子的世界其实并不小， 它可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。随着r n a i 技术在生命领 域的应用，越来越多的目光关注在一种内源性的小分子- - m i c r o r n a ( 简称 m i r n a ，微r n a ) 上，它与r n a i 和s i r n a 有着千丝万缕的联系，又与s i r n a 有着诸多差异。 m i r n a 是一类长度约2 2 n t 的非编码单链r n a 小分子，广泛存在于动植物 的细胞中，近几年在病毒等微生物中也发现了这种功能n c r n a 。最早发现m i r n a 的是l e e 等1 9 9 3 年在线虫中发现的l i i “，被称为反义r n a 和调控r n a ，它不 编码蛋白质，而以一种不完全互补的方式与其靶的3 u t r ( 非翻译区) 的特定区 域相互作用来抑制l i n - 1 4 的表达，最终导致l i n - 1 4 蛋白质合成的减少，这被称为 3 2 0 0 8 上海大学硕上学位论文 转译抑制。当时人们无法解释为什么一个2 2 n t 的r n a 分子起着如此重要的作用。 2 0 0 0 年r e i n h r r t 等又在线虫中发现了1 e t - 7 。由于它们的长度很短( 2 2 n t ) ，都参 与控制线虫的发育时序( d e v e l o p m e n tt i m i n g ) ，作用时间短暂，因此被成为小短 暂r n a ( s m a l lt e m p o r a lr n a 。s t r n a ) 。后来大量类似于l i n 4 和l e t - 7 的r n a 被 发现，对这些小分子r n a 的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面的研究 表明，它们是一类新的非编码小分子r n a ，具有重要的调控功能，与生物体的 阶段性发育密切相关，因此将这种小分子r n a 命名为m i c r o r n a ( m i r n a ) 。 m i r n a 能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶m r n a 的降解，有些m i r n a 以阶段特异性、组织特异性、细胞类型特异性方式表达。它们通过与靶m r n a 的特异互补位点结合，从而转录后抑制基因表达。m i r n a 序列、结构、丰度和 表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码m r n a 的调节子，对基因表达、 细胞周期调控乃至个体发育产生重要的影响【6 】。 1 2 2 预测m i r n a 的意义 m i r n a 是一类进化上保守的、在生命中起着重要调控作用的分子，它的发 现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在r n a 水平对靶m r n a 分子进 行更迅速有效的调节，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。由 于m i r n a 分子参与生物体生长、发育、衰老、死亡的调控，近年来又发现m i r n a 与人类疾病的发生有着千丝万缕的联系，因此识别m i r n a 并且研究其功能对认 识生命的发生、发展、死亡，以及预防和治疗人类疾病都有重要的意义。 随着相关研究的开展和深入，越来越多的m i r n a 基因获得了认知，并建 立起很多相关网站，其中m i r b a s e ( h t t p ：m i c r o m a s a n g e r a c u k c g i - b i n s e q u e n c e s ) 是收录已知各种生物m i r n a 基因的权威网站。在生物信息学的介入下，已知 m i r n a 基因的数量呈几何速度增长，2 0 0 3 年底约3 0 0 种，到2 0 0 8 年3 月，通 过生物信息学手段和分子克隆方法发现的各物种的m i r n a 基因已达5 3 9 5 种。 m i r n a 的表达具有时空特异性和组织特异性，分子克隆方法只能克隆出丰 度较高的m i r n a ，如果依赖分子克隆手段寻找丰度较低或某一阶段、某一组织 表达的m i r n a ，将面临很大的困难。分子克隆方法的局限性对生物信息学方法 提出了要求。其次，对m i r n a 的研究，无论在理论上还是应用上都只是一个开 始，要在基因组中找到每一个可能的m i r n a 基因，鉴定其遗传途径和生物学意 4 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 义，这将是一个巨大的挑战，需要将生物信息学、分子生物学、生物化学，以及 遗传学等学科的研究方法结合起来才能解决。由于还不完全了解m i r n a 的作用 机制，这就要求首先利用生物信息学的方法寻找可能的m i r n a ，然后利用生物 化学、遗传学的方法找到其在体内作用的证据并加以验证。由此可见，发展生物 信息学方法来预测m i r n a 基因就变得十分重要，并且将促进m i r n a 的进一步 研究。 1 3 论文工作与安排 随着m i r n a 发现的不断深入，研究者不仅在高等真核生物基因组中发现了 新的m i r n a ，同时也在感染高等真核生物的d n a 病毒基因组中发现了m i r n a 。 2 0 0 4 年，p u f f e r 等人在研究r n a i 在e b 病毒( e p s t e i nb a r r v i r u s ，e b v ) 感染人 b 淋巴细胞过程中的作用时，意外发现由病毒基因组编码的m i r n a ，从此病毒 m i r n a 的研究成为一个新的热点【7 】。病毒m i r n a 一般缺乏同源性，序列相似性 极低，这与其他生物m i r n a 在各个物种间具有高度的进化保守性不同，病毒 m i r n a 同源性只出现在进化关系极为密切的病毒之间。因此通过传统的同源片 段搜索或比较基因组学方法预测病毒m i r n a 就变得相当困难，甚至是不可能。 这就需要充分利用m i r n a 的生物学特征，挖掘生物信息学的潜力，使计算机方 法成为预测m i r n a 更加有效精确的方法。论文总结了m i r n a 的研究现状，介 绍了鉴定m i r n a 基因的两种方法川d n a 文库法和生物信息学方法，详细地介 绍了用计算机程序预测潜在的m i r n a 基因的方法，总结了它们的特点和不足。 针对病毒m i r n a 序列缺乏保守性的特点，我们开发了预测m i r n a 的计算机程 序m i r f i n d e r 。经过已知数据检测证明，该程序有很高精确度，对研究序列缺乏 保守性的m i r n a 有很大的帮助。 本论文共分五章，安排如下： 本章，阐述了生物信息学的发展历史，简要介绍了m i r n a 的发现历程和调 控功能，并且阐述了计算方法预测m i r n a 的重要意义。 第二章，介绍m i r n a 及其研究进展。首先介绍了m i r n a 的产生过程与作 用机制，这有助于比较m i r n a 与s i r n a 的异同。其次介绍了m i r n a 在序列和 结构上的特征，这些特征被称为生物学特征，是用计算方法预测m i r n a 的基础 5 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 和依据。另外还介绍了m i r n a 的功能，特别总结了m i r n a 在动物中的调控功 能。本章最后介绍了2 0 0 4 年新发现的一类m i r n a - 病毒的m i r n a 。 第三章，介绍了研究m i r n a 的两种方法。寻找m i r n a 主要有两条途径， 一是通过实验方法，即克隆分子的方法：二是通过生物信息学，即利用计算机程 序预测新的m i r n a ，并利用n o r t h e r n 杂交技术检测。文章详细介绍了计算预测 方法的发展现状，各方法的优越性和缺陷。同时还介绍了z u k e r 的最小自由能算 法。最后，我们利用参数训练、标准发夹结构判断和参数筛选的方法对病毒 m i r n a 进行预测，并分析了结果。 第四章，介绍了预测和探寻m i r n a 的计算程序m i r f i n d e r ，其流程、实现 算法、使用方法和功能等。 第五章，对全文工作进行总结，指出存在的问题，并对今后的研究工作进行 展望。 6 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 第二章m i r n a 及其研究现状 近年来，关于m i r n a 的研究已经从识别m i r n a 和阐明其作用机制转移到 鉴定其功能。并且，随着生物信息学的预测方法、原位杂交、过量表达、基因沉 默技术等的发展，一些m i r n a 的功能已经得到确认。这些m i r n a 的作用遍及 生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的过程。要研究m i r n a ， 首先要了解m i r n a 的生物合成、作用机制、功能和其与s i r n a 的异同等生物特 性，金由辛编著的核糖核酸与核糖核酸组学和宋尔卫主编的小分子r n a 的基础研究与临床应用两本书中，对此都做了详细的说明。 2 1m i r n a 的生物合成和作用机制 动植物细胞内的m i r n a 都是一组非编码蛋白质的小分子r n a ，有很高的保 守性。目前人们对动物m i r n a 的生物合成过程已经了解的比较清楚。首先，细 胞核内编码m i r n a 的基因在r n a 聚合酶i i 的作用下发生转录，形成长度约为 几百个核苷酸的初级转录物埘- m i r n a ，初级转录物在r n a s e i i i 家族酶 勘s h a 的作用下进一步被加工成为只含6 0 7 0 n t 具有茎环结构的单个m i r n a 前体舢i r n a ，由转运蛋白e x p o r t i n 5 运送到细胞质；在另一个r n a s d l i 家 族酶- d i c e r 的参与下，m i r n a 前体被加工形成双链m i r n a ，随后m i r n a 的双 链解链形成成熟的m i r n a 。成熟m i r n a 与核糖核酸蛋白结合形成一种类似r i s c ( t h er n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ) 的复合体m i r n p ，从而引起靶m r n a 的 降解或者翻译抑制【8 1 ( 如图2 1 ) 。m i r n a 对m r n a 到底是切割还是抑制，取决于 m i r n a 与靶序列互补配对的程度，互补配对程度高的可能进行切割，而配对程 度低的就只是抑制【9 ，。 而在植物中，细胞核内编码m i r n a 的基因的转录与加工是偶联的，即 m i r n a 的形成过程是在细胞核中完成的，不存在m i r n a 前体从细胞核到细胞质 的运输过程。首先，细胞核中编码m i r n a 的基因在r n a 聚合酶i i 的作用下转 录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物；然后再一种类d i c e r 酶d c l l 的 作用下形成m i r n a 前体，该前体长度一般为6 4 - 3 0 3 n t ，d c l l 继续作用于 7 2 0 0 8t 晦大学碰十学位论文 p r c - m i r n a 而形成双链m i r n a ；最后，双链m i r n a 在m i r n a 甲基转移酶h e n i 的作用下，使3 端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。甲基化的主要作用是阻止转 移酶、聚合酶的活性。毗卜过程均在细胞核中完成。成熟的m i r n a 或者是在细 胞核中与类似r i s c 的核糖核蛋白结合形成m i r n p ，然后被e x p o r t i n 5 的同源物 一h a s t y 运送到细胞之中，或者是先被h a s t y 运送到细胞质中，再与核糖核 蛋白形成m i r n p ，从而对靶m r n a 作用川。 2 2m i r n a 命名 d - 蔷蕞荔戡癌瞳瑟蒜菡 ) - 、 n d q n a d k 图2 1m i r a n 的生物台成与作用机制 随着近年来相关研究的进展，越来越多的m i r n a 被识别，研究中发现很多 m i r n a 是同源的，为了防止m i r n a 的混淆，研究者给它们做了命名规则【6 , t 2 j ： ( 除了l i n - 4 和j e f - 7 外，其他删r n a 统一用m i l l # ( 舯t 衷数字) 表示， 而m i r - # ( # 代表数字) 表示相应的编码基因； ( 2 ) 高度同源的m i r n a 在# 后加英文小写字母( 般从a 丌始) ； ( 3 ) 多基因拷贝的在后面加一n o ( 如m i r - 2 a - i ) 。 之后人们又对命名规则作了补充 u , 1 4 l 。不同物种中同源的m i r n a 最好用同 一 州m乒 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 一个名字；如果一个前体的两条臂上分别产生一个m i r n a ，则根据克隆实验， 观察成熟产物，次要的在后面加“ 号，如果蝇的m i r - 3 0 6 与m i r - 3 0 6 * ( 表示 量少的) ：如果不能区分表达量的多少， 和m i r 8 3 5 - 3 p ( s p 表示在5 端的臂上， 2 3m i r n a 的生物学特征 可以如下表达：如拟南芥的m i r 8 3 5 - 5 p 3 p 表示在3 端的臂上) u s 。 随着对m i r n a 研究的进展，生物信息学方法已经成为搜索m i r n a 基因的 重要途径，利用生物信息学方法的基础首先了解m i r n a 的生物学特征。m i r n a 在结构上有以下几个特点： ( 1 ) 通过n o r t h e r n 杂交或从大小分级的小r n a 文库中进行克隆可以检测 到约2 2 n t 的转录本【1 0 1 。报道过的所有m i r n a 长度在1 5 3 0 n t 之间，大部分在 2 1 2 2 n t 之间，这也是d i c e r 切割产生的s i r n a 的特点。虽然m i r n a 没有共同的 序列特异性，但是第一个碱基经常是u ，很少是g ，极少是c 【1 6 1 。 ( 2 ) m i r n a 前体折叠形成茎环结构，且不含有大的内环和突环。动物m i r n a 前体大约在7 0 n t ，而植物m i r n a 前体长度变化较大，一般从几十到几百个碱基。 成熟m i r n a 可以来自于茎环前体的5 侧或3 侧，一种估计是大约2 5 的m i r n a 来自于前体的5 侧，其他的则来自于3 侧。至于什么决定了前体的哪一部分会 产生稳定的产物还不清楚。有时候m i r n a 会来自于前体的两侧，例如m i r 5 6 和m i r 5 6 * ，这与d i c e r 切割产生s i r n a 相似。 ( 3 ) 成熟m i r n a 由d i c e r 加工而成，伴随d i c e r 功能活性的减少，可以检 测到生物体中前体的积聚。， ( 4 ) 动植物中一些m i r n a 的基因结构和功能在进化中呈现保守性。在 c c l c g a n s ( 秀丽隐杆线虫) 中发现的m i r n a ，8 5 都可以在c b r i g g s a e ( 桅杆线 虫) 的基因组中找到同源序列。几乎所有人类m i r n a 在小鼠中是保守的。拟南 芥的m i r n a 在水稻中也有很高的同源性。与此不同的是，近年来发现的病毒编 码的m i r n a 在不同的病毒中并不具有保守性，不同病毒m i r n a 的序列缺乏同 源性。另外，动、植物间没有发现完全相同的m i r n a 。动、植物间这种差异表 明，m i r n a 的起源可能源于动、植物分支之前，以后的适应性演变导致了两类 生物之间的差异。 9 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 ( 5 ) m i r n a 以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中。在动 物m i r n a 基因簇内，m i r n a 基因排列紧密，常常是基因头尾相接，茎环结构的 前体被短序列分开，这说明它们很可能来自于同一个转录物。 ( 6 ) m i r n a 通常位于基因间( i n t c r g c n i c ) 或位于内含子( i n t r o n i c ) 区域。 一些m i r n a 是由位于不同基因座上的基因编码产生的。植物中，分子克隆发现 的许多m i r n a 与基因组上的多个位点匹配，这说明m i r n a 基因是高度冗余的。 人类的l e t - 7 a 在基因组上有4 个匹配位点，其中两个前体是相同的。在有些情况 下，不同的m i r n a 基因编码的相关m i r n a 具有协同表达的特点。位于不同位 点的m i r n a 基因的协同表达暗示基因的启动子区域具有相同的调控元件。现在 还没有关于m i r n a 基因启动子的报道。 ( 7 ) m i r n a 的表达具有时序性和组织特异性。时序性即在生物发育的不同 阶段，有不同的m i r n a 表达。如m 小3 5 - - m i r 4 l 基因簇的m i r n a 在胚胎和成 虫早期高度表达，而在其他发育阶段不表达；组织特异性即在不同组织中可表达 不同种类的m i r n a ，如拟南芥m i r l 5 7 在幼苗中高表达，m i r l 7 1 在花中高表达， m i r l 7 3 在花和叶中高表达，而在根组织内表达的量很低，可见m i r a n a 有严格 的组织特异性。 2 4m i r a n a 的功能 l i n - 4 的功能是所有m i r n a 中描述最清楚的，并且认为l i n - 4 的一些特点在 其他m i r n a 中是真实的，例如在转录后调控特定基因的能力。对l i n - 4 基因有缺 陷的线虫的研究证明，m i r n a 在生物体内的调节作用是至关重要的。l i n - 4 既不 影响靶m r n a 的丰度也不影响翻译的起始，取而代之的是l i 州似乎是通过作用 于核糖体来阻止l i n 1 4 蛋白质的合成。虽然这种机制在已知的转录后调控机制 中并不普遍，但这种现象并不是唯一的。l i n - 4 通过靶3 u t r 中的不同元件发挥 作用，并且可能不是单独起作用的。抑制靶基因的转录并非l i l l 4 所特有，事实 上，它显示了动物界m i r n a 负调控其靶基因的机理。 总体来说，m i r n a 对动物的负调控作用具体体现在如下三点： ( 一) m i r n a 对动物发育的调控作用。 通过d n a 芯片技术，k r i c h e v s k v 等在2 0 0 3 年证明了在哺乳动物脑发育阶段 1 0 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 m i r n a 表达的精确调控，约有2 0 的m i r n a 的表达发生了显著变化，其中 m i r 1 9 和m i r 1 3 1 表达失调时，无早衰素的老鼠表现出严重的大脑缺陷；随后 相继发现，m i r n a 在调控线虫神经系统发育过程中发挥重要作用；美国哈佛医 学院的研究人员研究发现，m i r n a 通过转录后抑制h o x 基因表达，在脊椎动物 发育过程中发挥重要作用；美国华盛顿大学的研究人员证明在干细胞不断分裂的 过程中m i r n a 是必要的条件；b r u n e a u 发现现了m i r n a 是心脏形成过程的一个 靶标，同年，美国西北大学和卡耐基梅隆大学的研究人员合作研究发现，m i r n a 在调节卵生长过程中起到重要的作用。 在肌肉发育方面，a l e xc l o p 等证实，t e x e l 绵羊中的g d f 8 基因的3 u t r 内的一个点突变产生了一个可以在骨骼肌内高度表达的两个m i r n a ，即m i r 1 和m i r - 2 0 6 ，它们同时作用的靶位点，从而引起m i r n a 介导的m y o s t a i n 浓度在 转录后降低而造成肌肉造成肌肉肥大；c h e n 等证实，m i r 1 通过作用于h d a c 4 而促成肌细胞分化为成熟的肌肉细胞，抑制细胞扩增，m i r 1 3 3 则通过抑制s r f 而促进成肌细胞扩增，抑制其分化。 ( 二) m i r n a 对动物疾病发生的影响 研究表明，m i r n a 与人类的肿瘤形成、癌症发生密切相关。m i c h a e l 等发现 在人类直肠瘤形成过程中，m i r 1 4 3 和m i r - 1 4 5 表达量保持较低水平：v a nd e n b e r ga 等用s a g e 技术研究发现，霍奇金淋巴瘤中m i r - 1 5 5 b i c 高度表达( 达 9 1 ) ，作为对照，其在非霍奇金淋巴瘤中几乎不表达；随后c a l i n 等发现，在超 过6 8 的慢性淋巴细胞白血病例中，m i r - 1 5 a 与m i r 1 6 a 水平双双下调； t a k a m i z a w a 等发现肺癌病人的l e t - 7 表达显著降低；还有研究表明：淋巴瘤中， m i r n a 的一类m i r l 7 9 2 可能是潜在的致癌基因，并且发现一种叫做e - m y c 的转 录因子能调节m i r n a ；2 0 0 6 年，美国俄亥俄州立大学的v o l i n i a 等通过分析来自 肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品5 4 0 份，发现了有过 量表达的部分m i r n a 组成的实体癌症m i r n a 信号，在这些m i r n a 中包括 m i r - 1 7 5 p 、m i r 2 0 a 、m i r 2 1 、m i r - 9 2 、m i r - 1 0 6 a 和m i r 1 5 5 。这说明m i r n a 在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用。 ( 三) m i r n a 对动物细胞增殖和凋亡的影响 h i p f n e r 等在果蝇体内鉴定出第一个与增殖相关的m i r n a 基因b a n t a m 及其 2 0 0 8 上海大学硕士学位论文 靶基因h i d 。b a n t a m 与h i dm i r n a 的3 u t r 互补结合，阻止了h i dm i r n a 的翻 译，抑制蛋白的表达，