（生物化学与分子生物学专业论文）基于基因芯片数据初步分析绒毡层转录调控通路.pdf

摘要 花粉的正常形成，在植物的生殖过程中起重要的作用，花粉的正常 发育，既取决于配子自身的分子与细胞功能，也依赖于花药特别是绒 毡层细胞的供给支持。模式植物拟南芥绒毡层的发育过程由一系列复 杂的基因调控网络所控制，基因调控网络及特定基因与其它基因的调 控关系对于发育分子机理深入研究具有重要的意义。由于绒毡层在花 粉发育过程中的重要作用，目前已经有5 个与绒毡层发育相关转录因 子其的功能被报道。本实验室的前期工作确定了这5 个转录因子的上 下游关系。但是d y t l 、t d f l 、a m s 、a t m y b l 0 3 四个转录因子怎样 调控绒毡层发育，调控绒毡层发育的哪几个生物过程，目前尚不清楚。 本研究以拟南芥突变体d y t l ，t d f l ，a m s , m s l 8 8 的花序为材料进行生 物j 占片分析，产生高通量的实验数据。选取芯片信号值( 突变体野生 型) o 5 的基因作为下调基因，根据g o 和m a p m a n 数据库的信息将 不同突变体背景的下调基因逐一进行功能分类。经过分类分析，下调 基因，主要可以分为五个功能类：蛋白质降解、r n a 转录调控、细胞 壁合成降解、激酶受体和肽运输。 绒毡层发育与功能的转录调控通路中，我们发现d y t l 单独调控 次级代谢，t d f l 调控细胞活动，a m s 和a t m y b l 0 3 共同调控脂代谢。 d y t l 、t d f l 、a m s 、a t m y b l 0 3 转录因子共同调控的绒毡层发育过 程是影响蛋白质代谢、r n a 调控、细胞壁降解、信号激酶受体、肽的 运输这五个功能模块。 关键词：拟南芥绒毡层发育基因调控通路生物信息学 a b s t r a c t n o r m a lp o l l e nf o r m a t i o n ，w h i c hp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np l a n tr e p r o d u c t i v e p r o c e s s ，n o to n l yd e p e n d so nt h em o l e c u l a ra n dc e l l u l a rf u n c t i o no fi t so w n ，a l s o d e p e n d so nt h es u p p l yo fa n t h e r , i np a r t i c u l a r t h et a p e t u mc e l l m o d e lp l a n t a r a b i d o p s i s st a p e t u md e v e l o p m e n tc o n t r o lb yas e r i e so fc o m p l e xg e n er e g u l a t o r y n e t w o r k s r e g u l a t o r yn e t w o r k si sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t a p e t u md e v e l o p m e n t a st h et a p e t u mw o r k sa ni m p o r t a n t r o l e d u r i n gp o l l e n d e v e l o p m e n t ，ag r e a tn u m b e ro fs c i e n t i f i cw o r k e r sr e s e a r c ht h et a p e t u mg e n e sa n dh a v e r e p o r t e df i v et a p e t t m at r a n s c r i p t i o nf a c t o r sf u n c t i o n p r e l i m i n a r yw o r ki no u rl a b o r a t o r y h a sa l s oi d e n t i f i e df i v et r a n s c r i p t i o nf a c t o r s r e l a t i o n s h i p s h o w e v e r , t h eb i o l o g i c a l p r o c e s s e so f t a p e t u mr e g u l a t e db yd y t l ，t d f l ，a m s ，a t m y b l 0 3a r en o tc l e a r i nt h i ss t u d y , w em a k eu s eo fm u t a n t so fa r a b i d o p s i sd y t1 ，t d fi ，a m s ， a t m y b10 3t od ob i o c h i pt op r o d u c eh i g h t h r o u g h p u te x p e r i m e n td a t a w es e l e c tt h e g e n e ( m u t a n t w i l d t y p e 。m 一t d f l，j a 瞒蝴 目前已知五个转录因子d y t l 、t d f l 、a m s 、m s 1 8 8 和m s i 调控绒毡层发 育有关，它们在绒毡层发育过程中的作用在不同文献中都有报道。 d y t l d 汀1 ( a t 4 9 2 1 3 3 0 ) 是一个b h l h 家族转录因子，编码一个在花药发 育早期表达的b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ( b h l h ) 家族转录因子，控制着相当多的绒毡 层特异基因的表达。该基因突变体中绒毡层细胞能够形成，但随即出现异常空泡 化并且肥大，向药室内部挤压，导致小孢子提前降解 7 , 4 7 】。 t d f lt d f l 基因编码一个r 2 r 3 m y b 家族转录因子，减数分裂时期野生型 绒毡层形成一层规则的细胞层，特化为含有许多小液泡的分泌型结构。而突变体 的绒毡层的空泡化严重，并伴随着不规则分裂的现象，其在后期小孢子发育过程 中异常肥大并向药室内部挤压，同时小孢子逐渐降解【4 7 1 。 a m sa m s 基因编码一个b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ( b h l h ) 家族转录因子【引，通 过突变体研究发现其在绒毡层内特异性表达。据s o r e n s e n 等人的报道，在a b o r t e d m i e r o s p o r e s ( a m s ) 突变体中，绒毡层细胞在四分体释放后肥大且空泡化，导致小 孢子在四分体时期以后迅速降解。 m s 1 8 8 m y b l 0 3m y b l 0 3 基因编码m y b 家族转录因子，在绒毡层中特异 性表达并对绒毡层功能起重要作用。最新研究发现在m y b 3 3m y b 6 5 突变体中，绒 毡层在减数分裂时期变得异常肥大，导致小孢子的发育在减数分裂前期终止，暗 示其无法分化成分泌型细胞【5 , 4 6 , 6 2 】。相应的，由于绒毡层不能分泌胼胝质酶，突 1 6 鼢 鼯 一 上海师范大学硕士学位论文文献综述 变体四分体中的小孢子不能释放，而且其外壁合成等程序都被破坏，从而导致不 育，但这个双突变体在低温强光等适当的条件下育性会有所恢复。 m s lm s l 编码一个p h d f i n g e r 家族的转录因子，m s l 突变体的绒毡层在四 分体释放后开始出现空泡化现象，致使小孢子提前降解。最近的研究结果表明， m s l 突变体的绒毡层在分泌功能上受损，并且没有适时地发生细胞凋亡，而是可 能经历了另一种类似于动物中的伴随细胞坏死的应答的过程。芯片分析的结果显 示一些与p c d 过程相关的半胱氨酸蛋白酶在m s l 突变体中下调【6 a 8 】。在矮牵牛 中，t a z l 基因同样编码了一个p h d f i n g e r 结构的转录因子，该基因的沉默使绒 毡层程序性死亡机制无法被抑制，导致绒毡层提早衰退，从而产生不育性状。 1 7 上海师范大学硕士学位论文材料与方法 1 材料 1 1 植物材料与处理 第二章材料与方法 野生型拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ：生态型c o l u m b i a ( c 0 1 ) ，生态型l a n s b e r g e r e c t a ( l e r ) ，由本实验室保存。突变体m s l 8 8 - 1 ，m s l 8 8 - 2 ，d y t l 2 ( m s l 5 7 ) ，t d f l 由l e r 野生型通过e m s 诱变获得； s a l k 一1 5 2 1 4 7 ( a r e s 2 ) 由美国拟南芥种质资源中心 ( a b r c ) 提供。 1 2a giie n t 芯片平台 芯片平台选择a g i l e n t 的4 4 k 芯片。使用l o wr n ai n p u tl i n e a r a m p l i f i c a t i o n a n dl a b e l i n gk i tp l u s ( a g i l e n t ，5 1 8 4 - 3 5 2 3 ) 合成分别标记c y 3 和c y 5 的c r n a ，随 后用g e n ee x p r e s s i o nh y b r i d i z a t i o nk i t ( a g i l e n t ，518 8 5 2 4 2 ) ：将c r n a 对拟南芥4 4 k 全基因组芯片进行杂交，信号检测参照使用说明。每个点的c y 3 和c y 5 的信号 值用激光扫描仪( a g i l e n t ，g 2 5 6 5 b a ) ( 分辨率5 u r n ，p m t1 0 0 ) 分别扫描。随后用 f e a t u r ee x t r a c t i o ns o f t w a r e 软件对芯片整体信号进行均一化。 2 实验方法 2 1 拟南芥的种植 拟南芥种子浸泡于0 1 的琼脂糖中，然后置于4 中春化2 4 d 。将春化后 的种子播种于1 p n s 自然吸湿好的人工配比的培养基的盈子中( 尽量将种子分 散开) ，培养时在其上层罩一层塑料膜以保持湿度，放置于组织培养室中培养，培 养条件为：温度为2 0 2 5 ，光强为9 0 1 2 0 ue m 2s i ，光培养1 6 h ，暗培养8 h ，湿 度保持在6 0 7 0 ，生长期间注意浇水，保证培养基的湿度。当拟南芥长出第一 片叶子后去掉塑料层。当拟南芥生长到抽苔时期浇几次p n s 营养液，保证拟南 芥的营养，然后直至成熟。 2 2r n a 提取、纯化和c d n a 合成 r n a 提取 上海师范人学硕十学位论文材料与方法 称取1 0 0 m g 植物材料，用液氮在研钵中研磨成细粉，分装于两个1 5 m l 的 e p p e n d o r f 管中( 动作尽量迅速，以防止r n a 降解) 每管加入l m lt 砌z o l 用力摆动使混合均匀，室温下放置5 m i n ( 注意样品的 量不要超过t r i z o l 的1 0 ) 。 当样品中蛋白，脂肪，多糖含量较高时，离心，4 。c ，1 2 0 0 0 9 ，1 0 m i n ，将上 清吸入干净的1 5 m l 的e p 管。 每管加入0 2 m l 氯仿，用力振荡1 5 妙，室温放置2 3 ，离心，4 。c ，1 2 ，0 0 0 9 ， 1 5 m i n 。 将上清液吸入干净的1 5 m l 的e p 管中( 约6 0 0 u 1 ) ，加等体积异丙醇，颠倒 混匀，室温放置1 0 m i n 。 4 。c ，1 2 ，0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 弃上清，加l m l7 5 乙醇，振荡，离心，4 度，7 , 5 0 0 9 ，5 分钟。 室温干燥1 5 2 0 分钟。 溶于适量( 3 0 一5 0 微升) r n a a s e f r e ew a t e r 中。 吸取部分用于下部分反应，其余储存于- - 7 0 度冰箱( 注：在开始下一步反 应前需要先电泳检测和紫外分光光度仪检测所提取的r n a 的质量) 。 总r n a 纯化( q i a g e nr n e a s ym i n ik i t ) 总r n a 浓缩至1 0 0 u l ，加3 5 0 u lb u f f e rr l t ，混匀 加2 5 0 u l 无水乙醇，混匀( 不能离心) ，快速进行下一步。 o 将上述所得溶液转移至r n e a s ym i n is p i nc o l u m n ，1 2 0 0 0 r p m 离心15 s e e ，倒 掉废液。 加3 5 0 u lb u f f e rr w l 至柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s e c ，倒掉废液。 加1 0u ld n a s ei 至7 0u lb u f f e rr d d 中。 将d n a s ei 混合液( 8 0u 1 ) 加入柱中，室温放置1 5 m i n 加3 5 0 u lb u f f e rr w l 至柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s e e ，倒掉废液。 加5 0 0 u lb u f f e rr p e 至柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s e e ，倒掉废液。 加5 0 0 u lb u f f e rr p e 至柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n 。 将柱子转移至一新的离心管中，最大转速离心l m i n 。 将柱子转移至一新的离心管中，加3 0 u ld e p c 水至柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心 1 m i n 。 1 9 上海师范大学硕士学位论文 材料与方法 进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分析测定。 反转录合成e d n a 在r n a s e f r e e 的离心管中将1ugr n a 与o 5ugo l i g o ( d t ) 1 8 混匀，7 0 1 2 水 浴5 分钟。 取出迅速置于冰浴中5 m i n 。然后加入以下组分混匀： 5xr e a c t i o nb u f f e r 5 1 x l d n t pm i x t u r e ( 各2 m m ) 2 5ul r n a s i nr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r4 0 u n i t s m m l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e3 0u n i t s n u c l e a s e f r e ew a t e rt of i n a lv o l u m e2 5 i - t l 4 2 水浴6 0 m i n 。7 2 放置1 0 m i n 使逆转录酶失活。 2 3 芯片制作 用镊子将在土中生长5 周左右的拟南芥野生型及突变体未开放的花苞取下， 立即冻入液氮中，已开放的花及花苞都被去除。将材料冻存于8 0 。c 直至抽提总 r n a 。每份材料都备有3 次生物学重复。总r n a 抽提与纯化的步骤见2 1 2 部分， 纯化后的r n a 作为c d n a 合成的模板。以l u g 总r n a 为模板，使用l o wr n a i n p u tl i n e a ra m p l i f i c a t i o na n dl a b e l i n gk i tp l u s ( a g i l e n t ，5 18 4 - 3 5 2 3 ) 合成分别标记 c y 3 和c y 5 的c r n a ，随后用g e n ee x p r e s s i o nh y b r i d i z a t i o nk i t ( a g i l e n t ，518 8 5 2 4 2 ) 将c r n a 对拟南芥4 4 k 全基因组芯片进行杂交，信号检测参照使用说明。每个 点的c y 3 和c y 5 的信号值用激光扫描仪( a g i l e n t ，g 2 5 6 5 b a ) ( 分辨率5 u m ，p m t 1 0 0 ) 分别扫描。随后用f e a t u r ee x t r a c t i o ns o f t w a r e 软件对芯片整体信号进行均一 化。将那些信号比在3 个独立的生物学重复中( 突变体野生型) 2 ( f o ru p r e g u l a t e dg e n e s ) ，信噪比大于2 6 ， p v a l u e l o g r a t i o o ，称为正 相关，r o ，称为负相关，r = o ，表示不存在线性相关，具体标准： o l r l = o - 3 ，为微弱相关； 0 3 i r i = o 5 ，为低度相关； o 5 l r l = o 8 ，为显著相关； o 8 l r i = l ，为高度相关； i r l = l ，为完全线性相关； 2 5 依据m a p m a n 进行基因功能分类 依据m a p m a n 数据库( h t t p ：w w w m a p m a n o r g u k ) 提供的注释信息，把芯片 检出的差异基因进行蛋白质功能分类，具体分类原理参照相关的文献。 2 6p e ri 语言 p e r l 是p r a c t i c a le x t r a c t i o na n dr e p o r t l a n g u a g e 的首字母缩写，它是由 l a r r y w a l l 设计，并由他不断更新和维护p e r l 语言最初用于u n i x 环境下的编程语 言。p e r l 具有高级语言( 如c 语言) 的强大能力和灵活性【5 4 1 。p e r l 是一种脚本语 言( s c r i p tl a n g u a g e ) ，脚本语言是目前各种语言发展的方向之。p e r l 也是 一种解释型的语言。p e r l 还具有很多其它高级语言不具备的优良特性。其中，正 则表达式的特点是这个语言最大的特色。这与p e r l 的名称即p r a c t i c a l e x t r a c t i o na n dr e p o r tl a n g u a g e ( 实用提取与报告语言) 相一致。特别适用于 对网页女 i h t m l 和x m l 的解析。p e r l 可以直接进行模式匹配，p e r l 语言的复杂性也 2 l 上海师范人学硕士学位论文材料与方法 就是体现在高效使用j 下则表达式进行的模式查找上在生物信息学领域可以很方 便的用p e r l 的正则表达式进行序列的解析如著名的蛋白质m o t i f 数据库p r o s i t e 中的数据条目也是用正则表达式存贮的。用户可以用这种数据库中的结构或者功 能m o t i f 来分析自己的蛋白质序列，以便对自己分离到的蛋白质序列进行结构和 功能的预测。在国际上著名的b i o p e r l 项目的模块中，对各种b l a s t 、f a s t a 结果 报告的解析也使用了大量的正则表达式。 生物信息学的研究特点非常明显的表现在：第一，巨量数据计算，这是生物 信息学研究的最大特点如水稻基因组，中国华大基因中心测定的籼稻品种9 3 - 1 l 的基因组序列就有4 6 6 兆、而美国s y n g e n t a 公司t e r r y 实验室测定的粳稻品 种n i p p o n b a r e 基因组也有4 2 0 兆、人类基因组则更大有3 g 之巨。如果生物信 息学工作者要遍历一次一个基因组，可以比喻为拷贝一次几百兆的数据文件，这 个过程也要在目前的微机上也要好几分钟。而常常是一次计算要遍历很多次。第 二，序列分析中字符串处理占了大部分的内容，如数据库搜索，序列比对等，所 以在选择计算语言时必须考虑能很方便地进行字符串处理。第三，广泛的w e b 技 术应用，生物信息学研究中的w e b 技术包括w e b 客户端技术和w e b 服务器端 技术，两者缺一不可。w e b 服务器端技术可以充分发挥大型计算机的能力，实现 分布式巨量计算以达到资源共享。同时w e b 服务器技术可以很方便的实现对外 信息发布和信息交流。而w e b 客户端技术可以实现与大的数据中心共享巨型计 算的计算能力和数据。而p e r l 语言的种种特性恰好满足以上三点的要求，因此在 我们的课题中，p e r l 语言成为了我们首选的编程语言，用以实现项目的每一个步 骤。 上海师范人学硕十学位论文结果与分析 第三章结果与分析 3 1 芯片数据质量分析 在前期工作的基础上，为了进一步阐明转录因子d y t l ，t d f l ，a m s 以及 a t m y b l 0 3 在花药发育转录调控中的作用，我们利用基因芯片的方法对上述转录 因子突变体的花组织转录谱进行了分析。由于在花发育早期很难提取拟南芥的花 药，我们去除了野生型与突变体花序已开放的花，收集花苞抽提r n a 进行芯片杂 交，每张芯片进行了3 次生物学重复。获得了4 套共1 2 张表达谱基因芯片数据。在 舾一踬变体芯片中，3 7 6 8 5 个总探针组中，有2 6 4 8 5 ( 芯片1 ) 、3 1 2 0 1 ( 芯片2 ) 、 2 9 6 6 8 ( 芯片3 ) 个探针组可以检测出表达信号( p 2 ，下调基因的表达 阂值为：突变体野生型 0 5 ，依照这一标准，我们筛选出m s l 8 8 突变体中1 0 8 5 个差异性表达的基因( 其中上调基因数为1 8 9 个，下调基因数为8 9 6 个) ；砂t l 上海师范人学硕士学位论文结果与分析 突变体中1 9 2 4 个差异性表达的基因( 其中上调基因数为4 5 8 个，下调基因数为 1 4 6 6 个) ；t d f l 突变体中2 0 2 9 个差异性表达的基因( 其中上调基因数为5 3 6 个， 下调基因数为1 4 9 3 个) ；嬲突变体中1 2 2 4 个差异性表达的基因( 其中上调基 因数为1 8 3 个，下调基因数为8 9 6 个) 。如表3 1 所示。 表3 1 突变体中上下调差异性表达基冈的概括 突变体芯片强焉r 王碉确 3 - 3 四个突变体芯片的各自单独分析 为了研究每个突变基因在生物生命活动中的作用，我们把咖t l 、t d f l 、a i i i s 和m s l 8 8 中差异表达的基因进行了分析，主要分析是依据m a p m a n 和g o 进行差异 基因的蛋白质功能分类；依据k e g g 数据库已知的代谢途径数据，分析突变体中 改变的主要代谢途径。 3 3 1 通过m a p m a n 进行的功能分类 3 3 1 1 m a p m a n 第一层次分类 3 3 1 1 1 咖f 突变体芯片数据的分析 m a p m a n 依据代谢途径和生物学功能对拟南芥基因进行分类【3 7 1 。在第一层次 分类中，砂f 突变体的上下调基因可以分成3 1 个类。砂芒下调差异表达的基因 主要可以分在蛋白质代谢、r n a 合成、信号传导、转运、细胞壁代谢、应激反应、 脂类代谢、生长发育、激素代谢等几个代谢途径里( 如表3 2 ) 。因为m a p m a n 自 身分类中，每类所含的基因数区别很大，为了确定d y t l 上下调基因在所属类中 的重要性，我们做了每类基因在本类代谢途径中所占的比例分析( 如表3 2 比重 列) 。综合差异基因的数目和比重分析，咖芒j 突变体的差异基因分布在细胞壁代 谢、次生代谢、转运、激素代谢、金属离子结合以及发酵等不同的代谢途径里。 由于咖f j 突变体的表型为绒毡层细胞早期肥大，发育过程提前终止，故而后续 的细胞壁，脂类合成途径代谢都受到了严重的影响。 上海师范大学硕士学位论文结果与分析 p r o t e i n ( 14 2 7 6 ) 2 0 3 r n a f 9 8 4 6 ) 1 1 2 m i s t ( 4 6 2 2 1 1 0 8 s i g n a l l i n g ( 4 0 1 0 ) 9 2 t r a n s p o r t ( 3 4 3 7 ) 9 0 c e l lw a l l ( 1 5 5 7 )7 1 s t r e s s ( 2 7 1 6 1 5 6 l i p i dm e t a b o l i s m ( 1 6 l1 ) 3 3 d e v e l o p m e n t ( 2 0l6 ) 3 2 h o r m o n em e t a b o l i s m ( 1 5 6 7 ) 3 1 s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ( 1 5 1 4 ) 3 0 c e l l ( 2 7 6 9 ) 3 0 d n af 1 9 0 8 )1 5 r e d o x r e g u l a t i o n ( 9 3 0 ) 10 a m i n oa c i dm e t a b o l i s m ( 13 7 3 ) 10 m a j o rc h om e t a b o l i s m ( 5 2 6 ) 9 m e t a lh a n d l i n g ( 2 2 0 ) 7 m i n o rc h om e t a b o l i s m ( 5 4 9 )6 t c a o r g t r a n s f o r m a t i o n ( 4 5 0 ) 5 glycolysis(442)4 n u c l e o t i d em e t a b o l i s m ( 6 8 0 )3 f e r m e n t a t i o n ( 8 4 ) 3 c o f a c t o ra n dv i t a m i n em e t a b o l i s m ( 2 3 7 )2 m i t o c h o n d r i a le l e c t r o nt r a n s p o r t a i t ps y n t h e s i sf 5 6 3 ) 2 n m e t a b o l i s mf13 6 ) 2 b i o d e g r a d a t i o no fx e n o b i o t i c s ( 9 4 ) 2 g l u c o n e o g e n e s e g l y o x y l a t ec y c l e ( 4 7 ) l s a s s i m i l a t i o n ( 8 4 ) 1 t e t r a p y r r o l es y n t h e s i s ( 2 6 3 ) l p s ( 1 3 1 3 ) o 1 4 2 1 1 4 2 3 4 2 2 9 2 6 2 4 5 6 2 0 6 2 0 5 1 5 9 1 9 8 1 9 8 l o 8 7 9 1 0 8 7 3 1 7 1 3 1 8 1 0 9 1 1 1 9 4 4 3 5 7 8 4 3 6 1 4 7 2 1 3 2 1 3 1 1 9 3 8 0 2 2 6 6 1 2 3 2 7 5 8 1 1 6 6 6 5 6 5 5 1 2 1 2 5 2 0 7 0 5 4 3 4 4 1 1 4 4 5 5 5 4 4 4 5 2 9 0 4 2 1 8 0 1 0 6 o o 3 8 3 8 表2d y t l 差异表达基冈的功能分类( 代谢途径后数字为本途径所含基冈数) 3 3 1 1 2t d f l 突变体芯片数据的分析 t d f l 突变体的上下调基因可以分成2 9 个类。t d f l 下调差异表达的基因主 要可以分在蛋白质代谢、r n a 合成、信号传导、转运、细胞壁代谢、应激反应、 脂类代谢、生长发育、激素代谢等几个代谢途径里。( 如表3 3 ) 。为了确定t d f l 上下调基因在所属类中的重要性，我们同样做了每类基因在本类代谢途径中所占 的比例分析( 如表3 3 比重列) 。综合差异基因的数目和比重分析，t d f l 突变体 的差异基因同样分布在细胞壁代谢、次生代谢、转运、激素代谢、金属离子结合 以及发酵等代谢途径里。由于t d f i 基因的表达与d y t i 非常接近，而两个突变体 的表型也极为相似，该基因处于d y t l 的下游，芯片信息表明两个突变体的下调 孔酤卯u加坞掩9 n钞鲳24 6 6 l 3 2 2 2 oo，o o 5 上海师范大学硕十学位论文结果与分析 基因数据有8 0 的重复率，暗示d y t l 可能主要通过调控t d f l 来控制绒毡层发育 进程。 n o ta s s i g n e d ( 2 718 8)489 p r o t e i nf 1 4 2 7 6 ) 2 1 6 r n a ( 9 8 4 6 ) 1 1 9 m i s t ( 4 6 2 2 1 1 1 4 s i g n a l l i n g ( 4 0 1 0 ) 1 0 9 transport(3437)87 c e l lw a l l ( 1 5 5 7 )6 6 s t r e s s ( 2 7 1 6 ) 5 0 l i p i dm e t a b o l i s m ( 1 6 1 1 ) 3 4 c e l lf 2 7 6 9 )3 4 d e v e l o p m e n t ( 2 0 16 ) 3 2 s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ( 1 5 1 4 ) 3 l h o r m o n em e t a b o l i s m ( 15 6 7 )3 0 r e d o x r e g u l a t i o n ( 9 3 0 ) 12 d n af 1 9 0 8 )1 2 a m i n oa c i dm e t a b o l i s mf 1 3 7 3 )1 0 m a j o rc h om e t a b o l i s m ( 5 2 6 ) 8 m i n o rc h om e t a b o l i s m ( 5 4 9 ) 8 m e t a lh a n d l i n g ( 2 2 0 、6 t c a o r g t r a n s f o r m a t i o n ( 4 5 0 ) 6 glycolysis(442)4 n u c l e o t i d em e t a b o l i s m ( 6 8 0 )3 m i t o c h o n d r i a le l e c t r o nt r a n s p o r t a t ps y n t h e s i s ( 5 6 3 ) 3 f e r m e n t a t i o n ( 8 4 ) 3 c o f a c t o ra n dv i t a m i n em e t a b o l i s m ( 2 3 7 )2 t e t r a p y r r o l es y n t h e s i s ( 2 6 3 ) 2 p s ( 1 3 1 3 ) l g l u c o n e o g e n e s e g l y o x y l a t ec y c l e ( 4 7 ) l b i o d e g r a d a t i o no fx e n o b i o t i c s ( 9 4 1 1 1 8 1 5 1 1 2 1 2 4 7 2 7 2 2 5 3 4 2 4 1 8 4 2 1 1 1 2 3 1 5 9 2 0 5 1 9 1 1 2 9 6 3 7 3 1 5 2 1 4 6 2 7 3 1 3 3 9 4 4 5 3 3 5 7 8 4 7 6 o 8 2 1 3 1 0 6 1 8 5 3 8 4 1 6 5 1 3 1 6 1 5 3 6 1 3 5 1 8 2 l 2 9 3 2 4 6 2 2 l 1 5 2 0 0 2 3 0 0 2 7 5 o 1 4 1 3 2 4 7 9 6 1 3 3 8 1 1 8 8 9 1 3 9 1 8 5 3 2 1 0 2 9 1 1 4 3 6 9 1 2 2 2 3 7 4 3 6 o o 7 6 2 3 o 0 表3 3t d f l 差异表达基冈的功能分类( 代谢途径后数字为本途径所含基冈数) 3 3 1 1 3a s 突变体芯片数据的分析 a m s 突变体的上下调基因可以分成3 0 个类。当把a m s 上调和下调的基因进 行功能分类后，我们发现参与不同生物过程的基因之间存在差别，a m s 下调差异 表达的基因主要可以分在蛋白质代谢、r n a 合成、信号传导、转运、细胞壁代谢、 应激反应、脂类代谢、生长发育、激素代谢等几个代谢途径里。( 如表3 4 ) 。为 了确定a m s 上下调基因在所属类中的重要性，我们做了每类基因在本类代谢途径 中所占的比例分析( 如表3 4 比重列) 。综合差异基因的数目和比重分析，嬲 突变体的差异基因可能分在细胞壁代谢、次生代谢、转运、糖异生乙醛酸循环、 上海师范人学硕七学位论文 结果与分析 以及杂项代谢产物途径中。本实验室对a m s 等位突变体的树脂切片发现该突变体 的绒毡层发育缺陷与上述两个转录因子突变体也较为一致，芯片结果也证明该突 变体中受到抑制的途径与上述两个突变体的基本一致，这个结果也暗示a m s 处于 d y t i 以及t d f l 的下游。 n o ta s s i g n e df 2 7l8 8 )3 3 4 p r o t e i nf 1 4 2 7 6 ) 1 5 9 misc(4622)84 r n af 9 8 4 6 )7 6 t r a n s p o r t ( 3 4 3 7 ) 7 4 s i g n a l l i n gf 4 0l0 ) 6 4 c e l lw a l l0557)49 s t r e s s ( 2 7 1 6 ) 3 3 s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ( 1514 ) 2 8 d e v e l o p m e n t ( 2 0 l6 )2 4 l i p i dm e t a b o l i s m ( 1 6 1 1 ) 2 2 h o r m o n em e t a b o l i s m ( 15 6 7 )2 0 c e l l ( 2 7 6 9 ) 1 9 d n a ( 1 9 0 8 ) 1 2 m a j o rc h 0m e t a b o l i s m ( 5 2 6 ) 6 a m i n oa c i dm e t a b o l i s m ( 13 7 3 )5 t c a o r g t r a n s f o r m a t i o n ( 4 5 0 ) 4 glycolysis(442)4 r e d o x r e g u l a t i o n ( 9 3 0 ) 3 m i n o rc h om e t a b o l i s m ( 5 4 9 ) 3 m e t a lh a n d l i n g ( 2 2 0 )3 c o f a c t o ra n dv i t a m i n em e t a b o l i s m ( 2 3 7 )2 n u c l e o t i d em e t a b o l i s m ( 6 8 0 1 2 g l u c o n e o g e n e s e g l y o x y l a t ec y c l e ( 4 7 ) 2 n m e t a b o l i s mr13 6 )2 t e t r a p y r r o l es y n t h e s i s ( 2 6 3 ) 2 f e r m e n t a t i o n ( 8 4 ) 2 p o l y a m i n em e t a b o l i s mf 7 3 ) 1 m i t o c h o n d r i a le l e c t r o nt r a n s p o r t a t ps y n t h e s i s ( 5 6 3 ) l b i o d e g r a d a t i o no f x e n o b i o t i c sf 9 4 ) l 1 2 3 1 1 1 1 8 2 7 7 2 1 5 1 6 3 1 s 1 2 2 1 8 5 1 1 9 1 3 7 1 2 8 6 9 6 3 1 1 4 3 6 8 9 9 3 2 5 5 1 3 6 8 4 2 9 4 2 6 1 4 7 7 6 2 3 8 1 3 7 1 8 1 0 6 o 8 8 2 1 5 2 3 o 5 3 9 4 4 8 6 1 5 2 5 7 o o 0 1 9 2 9 o o 1 1 1 8 4 5 0 4 4 o 0 3 8 0 o o 1 0 6 表3 4 a m s 筹异表达基因的功能分类( 代谢途径后数字为本途径所含基冈数) 3 3 1 1 4m s l 8 8 突变体芯片数据的分析 m s l 8 8 突变体芯片数据的分析m a p m a n 依据代谢途径和生物学功能对拟南 芥基因进行分类。在第一层次分类中，m s l 8 8 突变体的上下调基因可以分成2 6 个类。m s l 8 8 背景中差异表达的基因主要可以分在细胞壁代谢、脂类代谢、次级 代谢、激素代谢、应激反应、r n a 代谢、蛋白质代谢、转运等几个代谢途径里。 ( 如表3 5 ) 。为了确定m s - 1 8 8 上下调基因在所属类中的重要性，我们做了每类 基因在本类代谢途径中所占的比例分析( 如表3 5 比重列) 。综合差异基因的数 2 7 n 勰b 8 2 6 屹b 3 4 n o o 4 o 0 o 3 0 0 0 o o 上海师范火学硕士学位论文结果与分析 目和比重分析，m s l 8 8 突变体的差异基因可能分在糖异生乙醛酸循环、细胞壁代 谢、信号转导、转运、次级代谢途径中，以比重来看，似乎与前三个突变体所抑 制的途径较为一致，但该突变体的绒毡层发育缺陷从四分体时期才开始，要晚于 上述几个突变体，所以芯片结果中差异表达基因的数目也较少。 n o ta s s i g n e d3 0l s i g n a l l i n g ( 4 010)84 p r o t e i n ( 1 4 2 7 6 ) 7 5 m i s c ( 4 6 2 2 ) 6 8 t r a n s p o r t ( 3 4 3 7 ) 61 r n af 9 8 4 6 ) 5 4 c e l lw a l l ( 1 5 5 7 )5 2 s t r e s s ( 2 7 1 6 1 3 8 l i p i dm e t a b o l i s m ( 1 6 1 1 ) 2 4 s e c o n d a r ym e t a b o l i s mf l51 4 ) 2 4 c e l l ( 2 7 6 9 ) 2 4 d e v e l o p m e n t ( 2 0 16 )2 2 h o r m o n em e t a b o l i s mf15 6 7 ) 16 r e d o x r e g u l a t i o n ( 9 3 0 ) l0 d n a ( 1 9 0 8 ) 1 0 m i n o rc h 0m e t a b o l i s m ( 5 4 9 ) 6 m a j o rc h om e t a b o l i s m ( 5 2 6 ) 5 m e t a lh a n d l i n gr 2 2 0 )5 a m i n oa c i dm e t a b o l i s mrl373)4 t c a o r g t r a n s f o r m a t i o n ( 4 5 0 ) 4 n u c l e o t i d em e t a b o l i s m ( 6 8 0 )2 g l u c o n e o g e n e s e g l y o x y l a t ec y c l e ( 4 7 ) 2 g l y c o l y s i s ( 4 4 2 ) 2 b i o d e g r a d a t i o no fx e n o b i o t i c s ( 9 4 ) 2 m i t o c h o n d r i a le l e c t r o nt r a n s p o r t a t ps y n t h e s i s ( 5 6 3 ) 1 2 0 9 5 3 1 4 7 1 7 7 5 5 3 3 4 1 4 1 4 9 1 5 9 8 7 1 0 9 1 0 2 1 0 8 5 2 1 0 9 9 5 2 2 7 2 9 8 9 2 9 4 2 6 4 5 2 1 3 1 8 表3 5m s l 8 8 差异表达基冈的功能分类( 代谢途径后数字为本途径所含基因数) 3 3 1 2m a p m a n 第二层次分类 蛋白质合成，r n a 代谢，细胞