（动物学专业论文）中国鮡科鱼类分子系统发育和石爬鮡属物种有效性的研究.pdf

曲南寸币范支学理学硕士学位论文 内容摘要 简要同顾了分子系统学的基本原理、研究方法、分析流程和系统发育分析方法等以及多变 量形态度量学特点与应用、跳科鱼类系统发育研究进展从而有助于理解本研究的方法、目的与 意义。 跳科( s i s o r i d a e ) 隶属于硬骨鱼( t e l e o s t e i ) 、鲇形目( s i l u r i f o r m e s ) 由r e g a n 于1 9 1 1 年建立。雠科共有2 0 属，5 0 种以上，在我国有1 2 属。有关此类群的分子系统发育的研究还很 贫乏，一些物种的分类还存在较大争议。 选择钝头鱿科缺属( l i o b a g r u s ) 鱼类的金氏缺( l k i n g i ) 和拟缘缺( l m a r g i n a t o i d e s ) 作为外类群。通过p c r 技术，扩增了长度为5 3 2b p 的金氏缺和拟缘缺以及长度为5 3 4 5 4 2b p 的1 1 种跳科鱼类( 3 1 个样品) 的1 6 sr r n a 基因片段。比对得到5 5 0 个位点的同源序列其中 简约性信息位点9 7 个，约占全部位点的1 7 6 。分析了姚科鱼类1 6 sr r n a 基因部分序列茎区 ( s t e mr e g i o n s ) 和环区( 1 0 0 pr e g i o n s ) 的进化特点：计算了k i m u r a2 - p a r a m e t e r 遗传距离： ， 并用邻接法、最大简约法、最大似然法重建了跳科鱼类分子系统树。鼯果表明：( 1 ) 环区平均变异 、 位点较茎区多，有很强的a 偏好性：( 2 ) 没有替代饱和现象：( 3 ) 分子系统树上鲢属和纹胸觥属 构成姐妹群，石爬虢属和熊属构成姐妹群。照属和原觥属构成姐妹群；( 4 ) 龌属、原兢属和摺鲢 属的系统发育位置不定，躯鲩鱼类井未形成一个单系类群；可能的原因是所得到的1 6 sr r n a 基 因片段信息位点太少；( 5 ) 青石爬鱿和黄石爬鲢可能是同一物种，中华桃和前臀鱿可能是同一物 种。1 y 将s 7 核糖体蛋白基因内含子2 首次用作遗传标记进行中国跳科鱼类的系统发育分析。通过 p c r 技术，扩增了长度为1 5 4 b p 的金氏缺和拟缘蛱以及长度为1 5 3 - 1 6 8b p 的1 1 种跳科鱼类( 1 7 个样品) 的r p s 7 基囡内含子2 序列，序列比对得到1 8 1 个排列盘点，其中筒约信息位点5 8 个。 占全部位点的3 0 9 。分析了削i 科鱼类s 7 核耱体蛋白基因内含子2 序列计算了p - d i s t a n c e 和 k i m u r a2 - p a r a m e t e r 遗传距离，并用邻接法、最大简约法、最大似然法重建了鲫i 科鱼类分子系统 树。由于替代饱和。系统发育分析时，投有选择外类群，髓卮。巨坯( b a g a d u s y a r r e l t i ) 甩作 f 树根分析 结果表明：( 1 ) 鱿科鱼类r p s 7 基因内含子2 序列具有丰富的信息位点，并且在亲缘 、 关系不同自守物种间存在显著的序列差异：( 2 ) r p s 7 基因内含子2 序列在r p s 7 基因进化过程中 发生了大量的碱基插入和缺失现象而且发生插入或缺失的情况可毹各不相褐；鱿科鱼类串有替 郭宪竞：中国姚科鱼类分子系统发育和石爬觥属物种有效性的研究 代饱和现象；( 3 ) 石爬鳞属和觥属聚在一起，形成姐妹群；拟鲤属和原觥属聚在一起，形成姐妹 群：但褶蹇j 8 属、照属的位置不定；( 4 ) 在m p 和m l 分子系统树中，鲲觥鱼类彤成一单系群：( 5 ) 青石爬觥和黄石爬姚可能是同一物种，中华劁i 和前臀鱿可能是同一物种。r 石爬觥属鱼类的青石爬鱿和黄石爬姚的物种界限一直不清楚。采用形态判别和线粒体1 6 s r r n a 基因片段分析相结合的方法，分别研究分析了青石爬桃和黄石爬跳的物种划分、地理分化 及遗传多态性。矗果表明：( 1 ) 区别青石爬跳和黄石爬跳的重要特征腹鲳起点至臀鳍起点的距离 是否大于至鳃孔下角的距离，腹鳍相对位置头部相对大小与上颌须的须状延长部分等相互之间 有一定的相关性，但是在研究的样本中没有截然的界限，而是有较大的重叠，难以区分：( 2 ) 从 地理分布看金沙江水系不同支流的样本在上述特征上有一定的区别，但是没有发现青衣江的样 本与其他支流的样本有截然的界限和明显的地理变化规律；( 3 ) 5 4 8b p 序列中，检测出2 个多 态位点，多态位点的比例为0 3 6 5 ；( 4 ) 青石爬觥和黄石爬鳞间的遗传差异极小，平均遗传距 离仅为0 0 7 5 ：( 5 ) 石爬觥属鱼类个体间也无明显差异，遗传距离为0 03 8 1 ，平均为o 0 6 9 。 因此，石爬跳属鱼类划分为一个种更为客观，黄石爬跳为青石爬觥的同物异名。1 ， 关键词：雠奔_ ，石爬赢。线粒体1 6 s ，r 百主因；s 7 核糖体蛋鹾茜；内含子；分子系磊i 育：形态度量学；物种有效性 矗 k 2 曲南师范大学理学硕士学位论文 a b s t r a c t m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c sh a sd e v e l o p e dv e r yq u i c k l yt h e s ey e a r s t h ef u n d a m e n t a l p r i n c i p l e r e s e a r c h m e t h o da n da n a l y t i c a lf l o wo fm o l e c u l a rp h i o g e n e f i c s a n dp h y l o g e n e u c a n a l y s i s a r e b r i e f l y r e v i e w e d a l s ot h ec h a r a c t e r i s t i ca n d a p p l i c a t i o n o fm u l t i v a r i a t e m o r p h o m e t r i c s a sw e l ta s t h ep h y t o g e n e t i ci n v e s t i g a t i o np r o g r e s so fs i s o d df i s h e s a r eb r i e f l y r e v i e w e dt o o t h ea b o v e h e l pi n t e r p r e tt h es i g n i f i c a n c ea n d m e t h o d so ft h ep r e s e n ts t u d y f a m i l ys i s o r i d a ew a se r e c t e db yr e g a n i n19 11 w h i c hb e l o n g st os i l u r i f o r m e s t e l e o s t e i t h e r ea r e2 0g e n ma n dm o r et h a n5 0s p e c i e s ( a m o n gt h e mt h eg e n u sg l y p t o t h o r a xi n d u d e s m o s t o f t h e s p e c i e so f s i s o n d a e ) a m o n g t h e m ，1 2g e n r a a r ed i s t r i b u t e d i n c h i n a m o s to f t h e s i s o r i df i s h e sa r ed i s t r i b u t e dt ot h em o u n t a i nr e g i o no fe a s th i m a l a y a s i nr u n n i n gw a t e ra n d d e e pv a l l e y s t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so ft h ef a m i l ya r en o tf u l l yi d e n t i f i e d a n ds o m e s p e c i e sv a l i d i t yi ss t i l lc o n t r o v e r s i a l l i o b a g r u sk i n g i a n dl i o b a g m s m a r g i n a 幻i d e sw e r ed e s i g n a t e da so u t g r o u p si nt h ep r e s e n t s t u d y , t h el e n g t ho f1 6 sr r n ag e n ef r a g m e n t o b 协i n e db yp c r a m p l i f i c a t i o nr a n g e s f r o m5 3 4 t o5 4 2 b p i nt h e1 1s i s o n ds p e c i e s ( 3 1s a m p l e s ) i n v e s t i g a t e d a n di s5 3 2b pi nl k i n g ia n dl m a 俘加a t o i d e s o u to ft h ea l i g n e dh o m o l o g o u ss e q u e n c e o f5 5 0s i t e so b t a i n e d ，t h ep a r s i m o n y i n f o r m a t i v es i t e sa r e9 7a n do c c u p y1 7 6 t h ee v o l u t i o n a r yc h a r a c t e r i s t i c so fb o t hs t e m sa n d l o o p so f1 6 sr r n a g e n ep a r t i a ls e q u e n c e w e r e a n a l y z e d t h e k i m u r a s2 - p a r a m e t e rd i s t a n c e s w e r ec a l c u l a t e da n dm o l e c u l a r p h l o g e n e t i c t r e e sw e r er e c o n s t r u c t e d b yu s i n g t h e n e i g h b o r - j o i n i n g ( n j ) m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m l ) m e t h o d s t h e r e s u l t ss h o wt h a t ( 1 ) 1 0 0 p sa r ei ng e n e r a lm o r ev a r i a b l et h a ns t e m s a n di nl o o p sas t r o n g a d e n i n eb i a sa r eo b s e r v e d ：( 2 ) t h e r ed o e sn u te x i s tas a t u r a t i o ne f f e c ti ns t e m s 。i o o p so ra l i p o s i t i o n so ft h e1 6 s r r n a g e n ef r a g m e n t s ；( 3 ) i nt h em o l e c u l a rc l a d o g r a m b a g a f i u s f o r m sa s i s t e rg r o u pw i t hg l y p t o t h o r a x ，a n de u c h i l o g a n i sf o r m sas i s t e rg r o u pw i t hp a r e u c h i l o g l a n i s - a n de x o s t o m af o r m sas i s t e rg r o u pw i t hg l y p t o s t e r n u m ：( 4 ) t h ep h l o g e n e t i cp o s i t i o n so f p s e u d e c h e n e i s e x o s l d m aa n dg l y p t o s t e m u ma r en o tr e c o g n i z e d ：t h eg l y p t o s t e r n o i df i s h e s a r en o t m o n o p h y l ya n h o u g ht h e y a r ed e f i n e d b y 13 o s t e o l o g i c a la p o m o r p h i e s ：t h e i n c o n g r u e n c eo fc l a d o g r a m sb e t w e e nm o l e c u l a ra n dm o r p h o l o g i c a ls e t sm a yb ec a u s e db y 3 郭宪竞：幸国跳秘鱼类分子系统发盲和石爬跳属物种有效性的研究 l e s si n f o r m a t i v es i t e so ft h e5 5 0 h o m o l o g o u ss i t e s ：( 5 ) e d a v i d ia n de k i s h i n o u y e ic o u l db e t h es a m e s p e c i e sa c c o r d i n gt ot h eg e n e t i cd i s t a n c e s ：尸s i n e n s i sa n dp a n t e a n a l i sc o u l db e t o o ， t h e2 n di n t r o n o ft h es 7r i b o s o m a lp r o t e i nf r p s t ) g e n ej sf i r s tu s e dt oe x a m i n et h e r e l a t i o n s h i p sa m o n gs i s o r i df i s h e s t h el e n g t ho ft h e2 n di n t r o ns e q u e n c e so b t a i n e db yp c r a m p l i f i c a t i o nr a n g e sf r o m1 5 3t o1 6 8b pi nt h e1 1s i s o n ds p e d e s ( 1 7s a m p l e s ) i n v e s t i g a t e d ， a n di s1 5 4b di nu o b a g r u sk i n g ia n du o b a g r u sm a r g i n a t o i d e s o u to ft h ea l i g n m e n to f1 8 1 n u c l e o t i d es i t e so b t a i n e d t h ep a r s i m o n yi n f o r m a t i v es i t e sa r e5 6a n do c c u p y3 0 9 o ft h et o t a l s i t e s ，p a i r w j s ec o m p a r i s o n so fu n c o r r e c t e ds e q u e n c e sd i s t a n c e sa n dk i m u r a2 一p a r a m e t e r d i s t a n c e sw e r ec a l c u l a t e da n dm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ct r e e sw e r er e c o n s t r u c t e db yu s i n gt h e n e i g h b o r - j o i n i n g 【n j ) m a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) ，m a x i m u ml i k e l i h o o d ( m e ) m e t h o d sd u e t o t h es a t u r a t i o n e f f e c t ，i n g r o u pr e l a t i o n s h i p s w e r ea n a l y z e dw i t h o u ta n yo u t g r o u ps p e c i e s s u b s e q u e n t l y , t h eb y a r r e f l iw a si n c l u d e di np h y l o g e n e t j ca n l a y s i sf o rr o o t i n gt h et r e e s t h e r e s u l t si n d i c a t et h a t ( 1 ) t h e2 n di n t r o ns e q u e n c e so ft h et p s 7 g e n e i ns i s o d df i s h e sa r ed c hi n i n f or m a t i v es i t e sa n dv a r yr e m a r k a b l y i n s e q u e n c ed i v e r g e n c ef r o md 6 b e t w e e nc l o s e s p e c i e st o2 9 9 b e t w e e nd i s t a n ts p e c i e s ：( 2 ) t h ei n s e r t i o n d e l e t i o n o fb a s e so c c u r r e d f r e q u e n t l yi nt h es e q u e n c e s o ft h e2 n di n t o nd u r i n gt h ee v o l u t i o no ft h er p s 7g e n e ，p r o b a b l y t h em e c h a n i s mo fw h i c hi sd i f f e r e n tf r o mo n ea n o t h e r ；( 3 ) i nt h em o l e c u l a rc l a d o g r a m e u c h i l o g a n i sf o r m sas i s t e rg r o u pw i t hp a r e u c h i l o g l a n i s a n dp s e u d e c h e n e i sf o r m sas i s t e r g r o u pw i t hg l y p t o s t e m u m t h ep h l o g e n e t i cp o s i t i o n so fp s e u c 培c h e n e i sa n de x o s t o m aa r en o t r e c o g n i z e d ；( 4 ) i nm p a n dm lc o n s e n s u st r e e s ，t h em o n o p h y l yo fg l y p t o s t e r n o i df i s h e sd o e s e x i s t ：( 5 ) e d a v i d ia n de k i s h i n o u y e ic o u l db et h es a m es p e c i e sa c c o r d i n gt ot h eg e n e t i c d j s t a n c e s ：ps i n e n s i sa n dp a n t e a n a i sc o u l db et o o t h ed e l i m i t a t i o nb e t w e e ne u c h i l o g l a n i sd a v i d ia n de u c h i l o g a n i sk i s h i n o u y e ih a sn o tb e e n c l e a ra l lt h et i m e w es t u d i e di n t e r - s p e c i f i ca n di n c a - s p e c i f i cv a r i a t i o n so fe d a v i d ia n de k i s h i n o u y e ib yp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sa n d5 4 8 b pm t d n a1 6 sr r n ag e n ef r a g m e n t s a n a l y s i s 3 5c h a r a c t e r sw e f - em e a s u r e da n da n a l y z e du s i n gm u l t i v a r i a t em o r p h o m e t d c s f o r8 0 s p e c i m e n so ft h eg e n u se u c h i l o g a n i s w ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e dt h em t d n a16 sr d n a i n 1 0i n d i v i d u a l so fe u c h i l o g l a n i s t h er e s u l t ss h o wt h a t ( 1 ) t h e d i a g n o s t i cc h a r a c t e r sb e t w e e n e d a v i d ia n de k i s h i n o u y e i , s u c ha sa n t e r i o rp o s i t i o no fv e n t m lf i n s 雎so r i g i nb e i n ga l w a y s 4 n e a r e ro rn o tt ot h el o w e ra n g l eo fg i l l o p e n i n gt h a nt oa n a lf i n m a x i l l a r yb a r b e l l se x t e n d i n g b e y o n do rn o tt og i l lo p e n i n g a r ec o r r e l a t e d h o w e v e r , s p e c i m e n sc o u l dn o tb e d i s t i n g u i s h e d d e f i n i t e l ya c c o r d i n gt ot h e s ed i f f e r e n c e sb e c a u s eo ft h eo v e r l a pi nc h a r a c t e r s ：( 2 ) t h e r ea r e d i f f e r e n c e s a m o n gp o p u l a t i o n s 们md i f f e r e n tl o c a l i t i e s b u tn od e f i n i t ec o r r e l a t i o nt ot h e t r i b u t a r yo fj i n s h a j i a n gr i v e r c o u l db ef o u n d ；( 3 ) t h e g e n e t i cd i s t a n c ei sv e r ys m a l lb e t w e e ne d a v i d ia n de k i s h i n o u y e ，a n di ti s o n l y0 0 7 5 o na v e r a g e ：( 4 ) o n l y2v a d a t j o nl o c ia r e d e t e c t e da n dt h em u t a t i o nr a t ei s0 3 6 5 ：( 5 ) t h eg e n e t i cd i s t a n c ei sa l s os m a l la m o n g t h e g e n u s e u c h i l o g l a n i s 。r a n g i n gf r o m0 - - 0 3 8 1 a n d0 , 0 6 9 o na v e r a g e b a s e do nt h e s er e s u l t s e u c h i l o g l a n i ss p e c i e s i nc h i n ai ss u g g e s t e da so n l yo n es p e c i e s a n d e k i s h i n o u y e i i sa r g u e d a sa s y n o n y m o f e d a v i d i k e y w o r d s ：s i s o d d a e ；e u c h i l o g l a n i s ；m t - 1 6 sr r n a g e n e = $ 7r i b o s o m a lp r o t e i n g e n e ：i n t r o n m o l e c u l a r p h y l o g e n e t i c s ；m o r p h o m e t d c s ：s p e c i e sv a l i d i t y 5 郭宪光：中国雠科鱼类分子系统发育和石爬觥属物种有效性的研究 第一章前言 在林奈双名法建立以来的2 5 0 年时间里，自然界中已有1 7 0 万种生物被描述。随着达尔文的 进化思想逐渐融入分类学，人们已经不再满足于了解自然界有些什么生物而要进一步探究自然 界中生物多样性的结构、起源和发展。正如h a e c h e l ( 1 8 6 6 ) 所言，“自达尔文时代起，许多生 物学家都有一个梦想，、那便是重建地球上所有生命的进化历史并以系统树的形式描述这部历史。” 近几十年来，生命科学和相关学科的不断发展和相互渗透尤其是分子生物学技术和计算机技术 的飞速发展和广泛应用，为系统和进化生物学研究带来了前所未有的发展，一门崭新的学乖 - 一 分子系统学( m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c s ) 迅速发展起来。 1 1 分子系统学 分子系统学是用分子生物学的技术和方法来研究生物多样性以及它们之间相互关系的科 学。它主要包括两大领域，即种群遗传学( p o p u l a t i o ng e n e u c s ) 和系统发生学( p h y l o g e n e u c s ) ， 前者主要研究种内分化后者主要研究物种多样性及种间系统发生。分子系统学研究的主要目标 是根据分子生物学数据构建系统发育树( p h y l o g e n e t i c t r e e ，或简称系统树) 进而推断出某一特 定类群系统发育的分支式样( s w o f f o r da n do l s e n ，1 9 9 0 ；s w o f f o r de t a ，1 9 9 6 = 钟扬等，1 9 9 4 ) 。 2 0 世纪5 0 年代初期，德国h e n n i g 提出了系统发育系统学( p h y l o g e n e u cs y s t e m a t i c s ) ，即 依类群系统发育关系进行分类的新理论。但由于种种原因直到6 0 年代中期，这一新的分类学 方法论才引起普遍的重视( h e n n i g ，1 9 6 6 ；w i l e y 1 9 8 1 ) 。这一理论也称为分支系统学 ( c l a d i s t i c s ) 其主要分析方法一分支分析广泛应用于系统与进化生物学研究及相关领域( 戎 嘉余等1 9 9 0 ：钟扬等，1 9 9 4 ；徐克学，1 9 9 4 ：赵铁桥1 9 9 2 ；黄大卫，1 9 9 6 ) 。目前分支 分析业已成为分子系统学中最重要的数据分析方法( s w o f f o r d a n d o l s e n 1 9 9 0 = s w o f f o r de t a ， 1 9 9 6 ) 。 1 1 1 基本原理 分子系统学的理论依据为：( 1 ) 生命的生化一致性和多样性原理：( 2 ) 生物大分子进化恒定 性原理；( 3 ) 表信息分子( 次生代谢物质) 的进化原理：表信息分子是生物迸化的产物其进化 是与代谢途径相关联的，它是基因型在分子水平上的表现型。这原理是表信息分子系统学研究的 遗传基础和依据。 分子系统学的方法基础为：( 1 ) 同源比较原理；( 2 ) 样品同质性原理( 黄贩，1 9 9 8 ) 。 6 西南师范大学理学硕士学位论文 1 1 2 研究方法 1 1 2 1 蛋白质水平的标记与检测 2 0 世纪5 0 6 0 年代，分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行。它有两个优点：( 1 ) 位点变化的规律可用经验模型描述，最著名的是d a y h o f f 模型( d a y h o f f e ta 1 9 7 8 ) ( 2 ) 即使 在密码子偏好性显著不同的物种间亦未发现有明显的氨基酸偏好性。但是，与核酸序列相比， 氨基酸序列的信息量较少。核酸中的某些变化( 如同义突变) 在相应的蛋白质序列中反应不出来。 因而有人主张核酸序列更好( m e y e r e ta ，1 9 9 1 ) 。 1 同工酶和等位酶电泳 此法可以在相对短的时间内检测出大量样本中许多座位上的遗传变异在种群水平上检测遗 传变异快速有效，方便节省。但它的缺点是可利用的遗传位点数量较小，只能检测编码酶蛋白的 基因位点，对非编码基因的变异则无能为力：同时，密码子同义突变的广泛存在使之无法检测全 部的d n a 变异，因而低估遗传变异水平，而且等位基因位点易受选择压力的影响( p o t e a u x e t a ， 1 9 9 8 ) 进一步降低了它用于估计遗传变异的精确性，因而等位酶数据实现系统发育重建说服力 较弱( s e m e r i k o ve t a ，1 9 9 9 ) 。 2 蛋白质立体结构测定 近年来测定蛋白质的立体结构成为获得分子系统学信息的新技术。由于蛋白质高级结构的 进化比一级结构要保守因此根据高级结构建立的系统发育关系更加可靠。生物大分子的空间立 体结构最能准确反映系统演化关系，随着技术的不断进步，蛋白质立体结构分析在分子系统学上 必将得到广泛的应用。 1 1 2 2d n a 水平的标记与检测 2 0 世纪7 0 年代分子系统学研究进入了核酸水平时期8 0 年代以来，以聚合酶链式反应 ( p c r ) 和s o u t h e m 杂交为基础发展了一系列衍生技术如随机扩增多态性d n a 技术、d n a 指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等，近几年来又发展了微卫星d n a 指纹图谱技术及核 酸序列测定技术，分子系统学在d n a 水平的研究飞速发展并取得了大量显著性成果 1 1 2 2 1 分子标记技术( 间接方法) 1 限制性内切酶片段长度多态性技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r f l p ) 该技术由b o s t e i n 和w h i t e 等于1 9 8 0 年提出，r f l p 分析数据多态信息量大结果稳定可 靠、重复性好，不受环境及物种发育阶段影响，但特异探针较难得到、步骤多、操作过程复杂、 7 郭完光：中国跳科鱼类分子系统发育和石爬跳属物种有效性的研究 周期长，对d n a 的需要量大且检测不到非酶切位点的变异，信息量少。因而在分子系统发育 方面的应用相对较少。 2 扩增片段长度多态性技术( a m l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r h i s m ，a f l p ) a f l p 是r f l p 与p c r 技术相结合产生的迄今最为有效的分子标记( z a b e a ue t a l ，1 9 9 3 ) ， 既有r f l p 的可靠性，又有r a p d 的灵敏度。但在分子系统发育的研究中该技术显得较为繁琐， 因而未能广泛采用。 3 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l p l i f i e dp o l i m o r p h i cd n a r a p d ) r a p d 技术是w i l l i a m s 等及w e l s h 和m c c l e l l a n d 于1 9 9 0 年同时提出的种建立在p c r 技 术基础上的一种分子标记手段( w e l i s he ta l ，1 9 9 0 ) 。r a p d 标记不需要预先知道任何d n a 序 列信息，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套随机引物可用于不同生物基因组分析。 该方法可同时检测多个位点，且常常是r f l p 标记不能检测到的重复顺序区。但r a p d 标记是一 种显性标记不能有效地鉴定出杂合子且r a p d 对反应条件敏感，实验的重复性差，结果难以 解释，这是r a p d 技术目前在应用上存在争议的原因。 4 微卫星d n a 指纹图谱技术 微卫星d n a 也称简单串联重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 在所有真核生物基 因组中随机分布，由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位呈现一定的多态性。微卫星d n a 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用( c h a m e s w o r t he t a t ，1 9 9 4 ) ，因而，被认为是遗 传信息含量最高的遗传标记( b o w c o c ke ta l ，1 9 9 3 ) 。徽卫星d n a 在基因组中多态性高，并且 等位基因数目多，呈等显性遗传其指纹图谱有极高的多态性结果稳定可靠，重复性好，适用 于任何真核生物的系统发育研究。但是微卫星座位突变机率高，对变异反应极其灵敏，所以易受 到趋同变异引起的平行演化程度的影响( 黄京飞等，1 9 9 7 ) ，从而给物种间亲缘关系的评估带来 误差。 1 1 2 2 2 核酸序列测定( 直接方法) 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方法即为核酸序列 分析方法。直接测定d n a 序列可以测出所有的d n a 变异，从而测得最为准确的遗传信息，但 是这一技术耗资较丈目前d n a 样品制备技术和d n a 序列图象的获得及数据分析方法都不十分 理想，序列数据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据 分析中的序列对准方法的不足都使得它目前的应用受到一定的影响。但动植物的基因组十分庞 大，目前除了一些模式生物外，对d n a 的全序列分析尤其是对种群的遗传多样性检测还是不 可能的( a v i s e ，1 9 9 4 ) 。进行序列测定的靶d h a 序列主要是一些迸化上的高变区，如m t d n a 的 8 西南师范土学理学硕士学位论文 一些区段：d l o o p 、c h b 、n d 4 等，核d n a 的某些序列：如i t s 序列、s 7 核糖体蛋白基因、 c m o s 基因等。 在分子系统学研究中的同源比较对象主要是d n a 中的核苷酸序列。p a t t e r s o n1 9 8 8 ) 讨论了 分子系统学中涉及的5 种周源序列：( 1 ) 正同源( o 广f h o l o g y ，或称直源) 序列：指由于物种形成 事件而产生的同源关系，存在于不同种间，是物种起源的证据反映物种血统上的同源性，可用 于构建种间系统发育树。( 2 ) 副同源( p a m l o g y ，或称并源) 序列：指由于基因复制事件而产生 的同源关系，存在于同一个体中是基因间同一起源的证据，反映基因的历史，可用于构建基因 问演化关系。如血红蛋白家族( h a e m o g l o b i nf a m i l y ) 中的m y o g o l b i n 、0 、y 、6 和e 链 ( g o o d m a ne ta ，1 9 8 7 ) 。( 3 ) 异同源( x e n o l o g y ，或称外源) 序列：由转染或不同支系间基 因横向转移而引起的同源关系，常存在于亲缘关系较远的类群之间，并不表明携带这些基因的类 群问的真正关系这种同源仅仅部分反映基因历史。( 4 ) 多异同源( p a r a x e n o l o g y ，或称并外源、 重复外源) 序列：与异同源的不同点在于主基因组中它拥有两个或更多的外源基因拷贝，是外源 基因复制引起的存在于一个个体的基因组中。( 5 ) 部分同源( p l e m l o g y 或称复源、嵌套同源) 序列：是由于外显子改组( e x o ns h u f f l i n g ) 引起的一个基因的外显子与另一个基因结合产生了 具有新功能的肽链，于是这种基因或其产物( 肽链) 与原来两种基因或肽链形成了部分同源关系。 这种重组基因或蛋白质起初一定是起源于同一基因组内但随着时间延长杂交基因也可随物种 形成事件而产生分异进化，成为部分直源基因。在分子系统发育研究中必须首先考虑正同源基 因序列，其它同源序列只能作为补充证据( 何舜平等1 9 9 8 ) 。 1 1 3 分析流程 9 郭宪光：中国劐l 科鱼类分子系统发育和石爬彰5 属物种有效性的研究 至匝圈曰 上上土1 l 上 3 1 。1 4 分子系统树的构建 系统发育研究的目的是：( 1 ) 建立各生物间正确的系谱学联系和( 2 ) 估计各生物自从它 们最后一个共同祖先那里分歧以来的分歧时间。在系统发育研究中，一组生物类群间的进化关系 常用系统树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) 来图示说明。表示一群物种的进化途径的系统树称物种树 ( s p e c i e s t r e e ) 。若系统树是根据来自各物种的一个基因构成的则该推测树即为基因树( g e n e t r e e ) ( n e i ，1 9 8 7 ) 。它与物种树有两个方面不同。第一，从两个不同物种取样的两基因的分歧 可能在时间上早于两物种的分歧。这将造成离估了枝长的结果但如果我们处理的是长期进化， 在这个过程中由物种内遗传多态性造成的分歧成分可以忽略的话，则这不至于出现严重问题。第 二，基因树的分歧模式( 即它的拓扑图) 可能与物种树的不同。 目前推测分子系统发育的方法主要有三种：最大似然法( m a x i m u m 乙k e l i h o o d m e t h o d ) 、最 1 0 玉南坼蓖大学理学硬士学位论文 大简约法( m a x i m u mp a r s i m o n ym e t h o d ) 和距离法( d i s t a n c e b a s e dm e t h o d ) 最大似然法( m l ) 考察数据组中序列的多重比对结果优化出拥有一定拓扑结构和树枝长 度的进化树，此进化树能够以最大的概率导致考察的多重比对结果。它给予观察的序列屋大合理 性，它允许系统发育推论使用复杂的进化模型。其包括估计模型参数的能力并且可以使有关进化 模型与进化过程的推论同时进行而且还提供比较不同树与模型的方法，似然法在系统发育系统 学中的巨大魅力在于其具有丰富和强有力的统计理论基础，例如具有执行统计假设检验的能力并 且若给予足够的数据和模型，m l 常得到非常正确的拓扑结构树( c h a n g ，1 9 9 6 ：r o g e r s 1 9 9 7 ) 。 m l 法对分子钟依赖较少( f e l s e n s t e i n ，1 9 8 1 ) 据h a s e g a w a ( 1 9 9 1 ) 的分析m l 浩也【午是目 前所有方法中准确性最高的一种。但其一个严重缺点是其计算量太大，在微机上运行得极慢。 最大简约法( m p ) 考察数据组中序列的多重比对结果，优化出的进化树能够利用最少的离 散步骤去解释多重比对中的碱基差异。m p 方法利用的只是对简约性分析能提供信息的特征。利 用m p 法重建系统发生树，实际上是个对给定a r u s 其所有可能的树进行比较的过程，对某一 个可能的