《酶工程》期末复习题整理.doc

第一章1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物， 亦称高级酶工程。4.酶工程的组成部分？答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。7.酶作用机制有哪几种学说？答：锁和钥匙模型、诱导契合模型8.酶催化活力的影响因素？答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。（二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法（三）沉淀法分级蛋白质 1.盐析法 2.有机溶剂法第二章1.固定化酶（p34）：所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化细胞（p53）：固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。偶联率（p57）：偶联率=(加入蛋白活力上清蛋白活力)/加入蛋白活力100相对活力（p57）：相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力上清中未偶联酶活力) 100酶的半衰期（p58）：指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。（半衰期是衡量稳定性的指标）活力回收（p57）：指固定化后固定化酶（或细胞）的总活力占用于固定化的游离酶（细胞）总活力的比例。2.固定化酶相比游离酶的优缺点（p34）？答：与游离酶相比，固定化酶具有以下优点:1.极易将固定化酶与底物、产物分开2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应3.在大多数情况下能够提高酶的稳定性4.酶反应过程能够加以严格控制5.产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺6.较游离酶更适合于多酶反应7.可以增加产物的收率提高产物的质量8.酶的使用效率提高成本降低。 同时，固定化酶也存在一些缺点:1.固定化时,酶活力有损失2.增加了生产的成本，工厂初始投资大3.只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜4.与完整菌体相比，不适用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应5.胞内酶必须经过酶的分离过程。3.固定化酶的制备方法及各方法的优缺点（p35-p42）？答：见p35-p424.固定化酶的制备原则（p34）？答：必须注意维持酶的催化活性及专一性。 为使固定化更有利于生产的自动化、连续化。其载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用 5.固定化酶的评价指标（p57）？答：固定化酶(细胞)的活力。固定化酶(细胞)的活力即固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下它所催化的某一反应的反应初速率来表示偶联效率及相对活力的测定。影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活，可用偶联效率或相对活力来表示。固定化酶（细胞）的半衰期。固定化酶（细胞）的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。半衰期是衡量稳定性的指标。第三章1.蛋白质的化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去,使酶分子共价结构发生改变，从而改变酶的某种特性和功能的过程。 交联剂（p85）：交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。 交联修饰：使用双功能基团试剂将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。 固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上。2.怎么控制修饰反应的专一性（p75）？答：（1）试剂的选择 用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下一些特征：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定；很易通过降解分离出来，进行鉴定；反应的程度能用简单的技术测定。 （2）反应条件的选择蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性，为了证明这一点，必须做对照试验；二是有利于专一性修饰蛋白质，为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。 （3）反应的专一性 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性选择不同的反应pH利用某些产物的不稳定性亲和标记差别标记利用蛋白质状态的差异。3.修饰主要包括哪些内容（修饰哪些基团）（p79-p83）？答：羧基的化学修饰、氨基的化学修饰、精氨酸胍基的化学修饰、巯基的化学修饰、组氨酸咪唑基的化学修饰、色氨酸吲哚基的化学修饰、酪氨酸残基和脂肪族羟基的化学修饰、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰第四章1.蛋白质的稳定性（p102）：蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影响、保持其生物活力的能力。 蛋白质工程：指用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质。2.酶蛋白稳定的分子原因（p102-p103）？答：（1）金属离子、底物、辅因子和其他低分子量配体的结合作用（2）蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用（3）盐桥和氢键（4）二硫键（5）对氧化作用敏感的氨基酸含量较低（6）氨基酸残基的坚实装配（7）疏水相互作用 3.酶蛋白不可逆失活的原因？答：（1）蛋白水解酶和自溶作用（2）聚合作用（3）极端pH（4）氧化作用（5）表面活性剂和去污剂（6）变性剂（7）重金属离子和巯基试剂（8）热（9）机械力（10）冷却和脱水（11）辐射作用4.稳定的主要方法有哪些（p110-p114）？答：（1）固定化（2）非共价修饰：反相胶束添加剂蛋白质间非共价相连（3）化学修饰：可溶性大分子修饰酶小分子修饰酶（4）蛋白质工程（5）酶的失活和再活化 第五章1. 反相胶束（p111）：反相胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形成的。依溶剂和表面活性剂的组成，可在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的反相胶束。 水活度（p146）：水活度（aw）定义为系统中水的逸度与纯水逸度之比，水的逸度在理想条件下用水的蒸气压代替，因此aw可以用体系中的水的蒸气压与同样条件下纯水蒸气压之比表示：aw=wxw 必需水（p146）：最适水量是保证酶的极性部位水合、表现活力所必需的，即“必需水”。它直接影响酶的催化活性和选择性。 化学修饰酶：酶蛋白分子的主链进行切割、剪切、以及在侧链上进行化学修饰，使其结构、性质改变后的酶 印记酶：p1522.非水相的催化与水相催化相比的优点（p125）？答：（1）增强难溶于水的反应物的溶解度（2）在有机介质中改变反应平衡（3）酶制剂易于回收再利用（4）在有机溶剂中可增强酶的稳定性（5）在有机溶剂中可改变酶的选择性（6）不会或很少发生微生物污染。3.非水介质有哪些（p126-p129）？答：（1）水-有机溶剂单相系统（2）水-有机溶剂两相系统（3）含有表面活性剂的乳液或微乳液系统（4）微水有机溶剂单相系统（5）无溶剂或少溶剂反应系统（6）超临界流体系统（7）离子液体（8）气相反应介质4.非水介质中的选择催化有何特点（p133-p135）？答：（1）底物特异性。酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性（2）对映体选择性：酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力（3）位置选择性。有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应（4）化学键选择性。5.有机溶剂的影响体现在哪些方面（p141-p143）？答：（1）有机溶剂对酶的结合水的影响（2）有机溶剂对酶的影响：有机溶剂对酶的动态的影响、溶剂对酶结构的影响、溶剂对酶活性中心的影响、酶活力和溶剂属性的定量关系模型（3）溶剂对底物和产物的影响（4）溶剂对酶活性和选择性的调节和控制第六章1.表面分子印记（p196）：在大孔硅胶表面，应用通常的分子印记法可产生具有分子识别能力的微孔聚合薄层。类似这样在某些载体表面产生分子印记空腔或进行表面修饰产生印记结合部位的过程称为表面分子印记。 生物印记（p198）：是分子印记的一种形式，它是指以天然的生物材料（如蛋白质和糖类物质）为骨架，在其上进行分子印记而产生对印记分子具有特异性识别空腔的过程。 模拟酶（p178）：一般说来，它的研究就是吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。也就是说，人工模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特征的一门科学。 肽酶（p189）：肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。 半合成酶（p190）：它是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。 分子印记（p193）：如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印记。2.模拟酶的种类（按属性分）(P179)？答：主-客体酶模型、胶束酶模型、肽酶、半合成酶、分子印记酶模型、抗体酶以及杂化酶和进化酶等。3.制备分子印迹聚合物包括哪些步骤（p195）？答：选定印记分子和单体，让他们之间充分作用在印记分子周围发生聚合反应将印记分子从聚合物中抽提出去。于是，此聚合物就产生了恰似印记分子的空间，并对印记分子产生识别能力。第七章1.抗体酶（p210）：也叫催化抗体，它本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。2.抗体酶的制备方法有哪些（p211-p214）？答：（1）稳定过渡态法（2）抗体与半抗原互补法（3）熵阱法（4）多底物类似物法（5）抗体结合部位修饰法（6）蛋白质工程法（7）抗体库法。3.抗体酶活性部位修饰有哪两种方法（p214-p215）？答：（1）定点突变。定点突变即蛋白质工程法，用此法可精确改变蛋白质肽链上的任一氨基酸残基，因此，可用来阐明某一氨基酸残基在抗体结合和催化中的作用（2）化学修饰法。修饰抗体酶，可以改善抗体酶的性质，如提高其活力、改变专一性等。第八章1.核酶（p226）：具有催化功能的RNA 脱氧核酶（p226）:人工合成的具有催化功能的DNA2.根据催化功能，核酶分为哪几类(P226-P227)？答：（1）剪切型核酶。这类核酶主要催化自身或异体RNA的切割，相当于核酸内切酶的作用。目前发现的剪切型核酶包括：锤头型核酶 发卡型核酶HDVRNaseP （2）剪接型核酶。这类核酶主要催化mRNA前体的修饰加工，切除内含子，并完成片段的拼接，主要包括类内含子和类内含子。3.影响核酶活性的因素？答：（1）pH值对活性的影响（2）二价金属阳离子对活性的影响：Mg2+，Mn2+（3）抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应（4）变性剂对活性的影响（5）温度对活性的影响4.核酶、脱氧核酶体外筛选方法有哪几种（p230-p231）？答：（1）SELEX技术。从随机寡核苷酸文库中筛选出与靶分子特异结合序列的组合化学技术，随机寡核苷酸的多种空间结构是筛选基础（2）动态组合筛选法。动态组合化学法利用可逆化学法应，使组合库中的结构单元进行动态结合和交换，能够有靶向性地为生物大分子设计、合成和筛选其特异性配体。5.核酶导入细胞有哪两种方式（p237）？答：（1）外生性导入，即把预先合成的核酶直接引入到细胞内（2）内生性导入，这种方法是将编码核酶的基因由载体带入细胞内，然后再转录产生核酶。第九章1.进化酶：利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术，対天然酶分子进行改造或构建新的非天然酶。 酶分子的合理设计（p243）：是利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法获得有关酶分子的结构、特性和功能的信息，并搞清结构与功能之间的关系，然后以此为依据，采用改变(修饰)酶分子中个别氨基酸残基的方法对酶分子进行改造，产生具有新性状的酶分子，因而该方案称为酶分子的合理设计，如化学修饰、定点突变等。 酶分子的非合理设计（p243）：在事先不了解酶分子三维结构信息和催化机制，对酶的结构与功能的相关性知之甚少的情况下，人为地创造特定的进化条件，在体外模拟漫长的自然进化过程 (随机突变、基因重组、定向选择或筛选)，使基因发生多种变异，最后定向选择或筛选出所需性质或功能的突变体酶，该策略称为酶分子的非合理设计，如定向分子进化 、杂合进化等。2.定向进化多样化的基本方法有哪些？内容是什么？（p245-p249）答：（1）易错PCR：是指利用Taq DNA聚合酶不具有3 5校正功能的特点，在特定条件下对待进化酶基因进行PCR扩增时，以较低的频率向目的基因中随机引入突变的一种技术。（2）DNA改组：DNA改组又称为有性PCR。是将一组密切相关的序列片段化，再通过重组创造新基因的方法。（3）族改组：将DNA改组用于