【毕业学位论文】（Word原稿）Asia I型口蹄疫病毒空衣壳抗原的表达与免疫研究预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 型口蹄疫病毒空衣壳抗原的 表达与免疫研究 of of of of I 摘 要 2005年在我国 数省区 爆发的 而 利于防控工作的开展 。因此 本研究选用 ，对其 编码区序列进行了测定，并借助计算机软件进行了生物信息学分析。在此基础上，利用家蚕杆状病毒表达系统表达了空衣壳抗原，并对表达产物进行了免疫效力评估。 （ 1） ：通过 法获得 了 ，并应用 件进行了生物信息学分析。 通过 与国内外典型代表毒株进行比较与分析，结果显示该毒株结构蛋白编码区与 参考毒株同一区域同源性较高，而非结构蛋白编码区L、 与 O 型参 考毒株同一区域同源性较高。从利用 白编码区绘制的系统进化树分析， ，而利用 非编码区绘制的系统进化树却表明与 O 型的两株病毒遗传距离较近。据此推测该毒株为一株 O 型与 型 重组毒株。 （ 2） 运用 法、 法和 法预测了 。运 用 法对 结构蛋白的亲水性进行分析，用 蛋白的表面可及性，以 法预测了结构蛋白的抗原指数。然后综合评价了 。 结果表明 个结构蛋白上存在 较多 潜在的 B 细胞表位， 也存在着少量的抗原 表位。这一结果提示在设计 因工程疫苗时应予以综合考虑，不应局限于 白。 （ 3） 将 ， 构建重组家蚕杆状病毒转移质粒 线性化的亲本病毒 转染家蚕细胞 ，经空斑筛选后 成功获得 了 携带有 长 重组病 。通过免疫荧光技术证明重组病毒能够正确表达插入的外源基因。 将获得的重组病毒 染家蚕 5 龄起幼虫，通过双抗体夹心 和电镜观察证明目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳 。 用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫 牛，免疫动物均产生了特异性抗体。免疫后 21 天进行 病毒攻击保护试验，获得了 2/4 的保护率。 （ 4）采用类似的方法构建了包括 （ 通过免疫荧光技术证明重组病毒能够正确表达插入的外源基因。 双抗体 测定目的蛋白在蚕体上获得了极高的表达量。通过电子显微镜技术，在蚕血淋巴中观测到大量的 毒空衣壳。将表达产物制备成疫苗一次免疫牛后，实验动物产生了针对 特异性抗体。28 天后使用 10,000源强毒攻击 ，获得了 4/5 的保护率。 （ 5）参照 定的 定法进行 了 达产物的 免疫效力实验 。结果显示 以 稀释 40 倍 抗原制备的疫苗 其 为 以 稀释 30 倍的抗原制备 的疫苗 其 一结果为利用家蚕杆状病毒生产的空衣壳疫苗 最终 走向市场奠定了良好的前期工作基础 。 关键词 ： 蚕杆状病毒表达系统 ， 免疫效力 is of of 005, by in of is In we , 1. RF , P2 3. of , by to of is as in P3 be of 3. RF of (RF to th of in by be in as to in 0,000 of of in 4. 11C ( IV in 00 or as to in of in 5. We by IE to 50 % on 0,000 of of 0 of 0 to a it is to of MD V 目 录 第一章 绪 论 . 1 究的目的及意义 . 1 内外研究进展 . 1 因组研究进展 . 1 型分子疫苗研究进展 . 4 空衣壳疫苗研究进展 . 6 家蚕杆状病毒表达系统研究进展 . 9 究内容和方法 . 11 第二章 、质粒、宿主菌株 . 12 参考毒株 . 12 工具酶及其它试剂盒 . 12 引物设计与合成 . 12 病毒 提取 . 12 应 . 13 物的纯化、回收 . 13 化产物与 体连接 . 14 感受态细菌的制备 . 14 粒 提取 . 15 组质粒的鉴定 . 15 列的比较及其基因特征研究 . 15 果 . 16 物的电泳结果 . 16 目的基因的鉴定结果 . 16 序列测定 . 16 L 区的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较与分析 . 16 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较与分析 . 17 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较与分析 . 18 的核苷酸序列及其推导的氨基酸 序列比较与分析 . 18 统发生树分析 . 18 论 . 20 第三章 构蛋白的二级结构及 B 淋巴细胞抗原表 位预测 . 22 料与方法 . 22 、传代及病毒繁殖 . 30 超速离心法制备病毒 因组 . 30 因组 线性化 . 30 共转染 . 31 重组病毒的筛选、纯化和扩增 . 31 重组病毒的鉴定 . 31 胞内表达 . 31 家蚕中的表达 . 32 衣壳电镜观察 . 32 免疫动物 . 32 检测血清抗体 . 32 病毒攻击保护实验 . 32 果 . 33 重组病毒 构建 . 33 胞中表达结果 . 33 蚕体中的表达结果 . 34 电镜观察结果 . 35 血清中抗 异性抗体 . 35 攻毒保护实验 . 35 论 . 36 第五章 Q 株 3C 基因的表达及其产物免疫原性分析. 38 料与方法 . 38 病毒和细胞系 . 38 重组杆状病毒转移载体的构建 . 38 构建与筛选重组 3C 基因的杆状病毒 . 39 多 聚蛋白 在 胞内表达 . 39 多聚蛋白 在家蚕中的表达 . 39 筛选高表达克隆毒株 . 39 表达时相测定 . 39 免疫动物 . 39 检测血清抗体 . 40 毒攻击保护实验 . 40 果 . 40 重组病毒 构建 . 40 多聚蛋白在 胞中表达结果 . 40 多聚蛋白在蚕体中的表达结果 . 42 高表达量病毒克隆筛选 . 42 表达时相的测定 . 43 电镜观察结果 . 43 血清中抗 异性抗体 . 44 攻毒保护实验 . 44 论 . 45 第六章 衣壳疫苗 测定 . 47 料与方法 . 47 疫苗制备及检验 . 47 试验动物 . 47 免疫效力试验 . 47 攻毒及判定标准 . 47 果 . 47 疫效力实验 . 47 论 . 48 第七章 全文结论 . 50 参考文献 . 51 附 录 . 67 致 谢 . 91 作 者 简 历 . 92 中国农业科学院 博士 学位论文 第一 章 绪论 1 第一章 绪 论 究的目的及意义 口蹄疫（ 是由口蹄疫病毒 （ 引起偶蹄动物的一种急性、 热性、 高度接触性 传染病，以传播迅速、感染率高而著称 (蔡宝祥 , 2001)。 感动物范围很广，包括牛、猪、羊等 20 科的约 70 多种家养和野生动物（ 1981） 。 旦爆发将造成巨大的经济损失， 因此 世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为 A 类传染病之首。 据 界咨询实验室统计， 19581990 年间有近百个国家和地区流行过 2001)。 分布与一个国家和地区的发展水平有关，非洲、亚洲、南美洲的一些国家由于没有充足的财力及有效的防控措施，致使该病不断流行。进入 21 世纪后 ，一些已消灭 年的国家又再度爆发 。 这些多年来未发病又没有接种 苗的国家或地区，由于动物高度敏感，一旦发病，传播极为迅速，往往造成灾难性的后 果。 如 2001 年 2 月的英国口蹄疫大流行，给英国造成经济损失估计高达 80 亿美元 (2001; 2002)， 继发的荷兰也杀了 20 万头动物 (2002)。 2000 年我国周边国家如韩 国、日本 也爆发了 亚洲的地区的经济和贸易造成很大影响。疫源的存在决定了 在我国乃至全球流行的潜在危险性。 目前对于 防控主要是采取屠杀、隔离和免疫接种等方式 (张永光 , 1994)。在发展中国家 ，接种疫苗是保护动物免受病毒感染、预防疾病流行的有效手段。尽管传统疫苗在 防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵、免疫期短、 疫