第八章酶分子定向进化（提纲）2013

1、第八章酶分子定向进化一、酶分子定向进化的目的为什么要研究酶的定向进化?天然酶的局限性在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低存在产物抑制稳定性差，活性低，催化效率低有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。二、酶分子的改造酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学

2、、晶体学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计。酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计。问题：定向进化是不是定点突变？澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是

3、以 PCR 技术为基础的。什么是酶的定向进化?从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的1突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。酶分子定向进化研究的历史萌芽阶段：20 世纪 60 年代 Sol Spiegelman 利用 RNA 噬菌体 Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程奠基阶段：20 世纪 80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶分子的新思想发展阶段：20 世纪末期易错 PCR 和 DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟如何使酶分子定向进化?定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选三、酶

4、分子定向进化的基本策略和方法定向进化的基本策略一般而言，定向的分子进化有三种方法：（1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含 1-2 有益突变的积累。（2）随机突变继之筛选两个或更多的改进的突变体重组，使有益突变组合并消除有害突变。（3）同源基因顺序重组(族改组) 产生功能嵌合蛋白质，并且允许一步完成许多有益突变的组合，包括非累加突变。定向进化的两个重要环节多样性基因文库的构建文库中所期望的进化酶的挑选定向进化的基本过程酶定向进化通常分 3 步进行：通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性导入适当载体后构建突变文库通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环

5、，直至得到预期性状的酶定向进化的基本方法无性进化易错 PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变和随机寡核苷酸突变等有性进化DNA 改组（DNA shuffling）、外显子改组（exon shuffling）、随机引物体外重组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等。易错 PCR(error-prone PCR)技术为代表的无性进化2一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。通过改变 PCR 反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制 DNA 的突变频率。易错 PCR 技术的特点优点操作简便，随机突变丰富缺点正突变的概率低，中性突变较多，突

6、变基因文库较大，文库筛选工作量大，一般适用于较小基因（ 106 cells/s）具有固定化酶的特征，易实现酶的定向进化与发酵耦联（2）细菌细胞表面展示法革兰氏阴性菌的外膜蛋白仅有一些表面环可作为插入外源蛋白的“允许位点”， 并且通常只允许插入很短的外源蛋白。单层膜转移阳性菌结构坚固革兰氏阳性菌的一个潜在问题是其转化率较低。75、核糖体表面展示法体外核糖体展示肽库构建与筛选原理示意图特点通量大、筛选效率高目的蛋白基因在体外进行转录和翻译，有效基因通过核糖体表面展示进行富集不足需要对目的基因进行加工与修饰，使其体外翻译时能够形成目的蛋白质-核糖体-mRNA 三聚体五、酶分子定向进化的应用1、提高酶

7、分子的催化活力这是对酶分子进行改造的最基本愿望之一，大多数酶的定向进化都涉及对目标酶催化活力的提高，还同时提高了酶的其它性能。2、提高酶分子的稳定性在酶分子进化研究中，大量的研究目标是提高酶分子的热稳定性。e.g. Joyet 等人通过定向进化，获得热稳定性大大提高的 -淀粉酶，该酶在90的半衰期延长 9-10 倍。3、提高酶分子对环境的适应能力天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境往往不同，采用定向进化的方法提高酶分子对环境的适应能力十分必要。e.g.枯草杆菌蛋白酶 E 的定向进化，获得的突变体在二甲基甲酰胺（DMF）中催化肽合成反应时，活力远高于野生型酶。4、提高底物专一性或拓宽特异

8、性底物范围通过定向进化可改变酶的 Km 值，即改变酶的底物专一性；反之，有些酶通过定向进化反而拓宽了酶的特异性底物范围。e.g1. Aharoni 等人采用基因家族重排技术对大肠杆菌磷酸酶进行分子定向进化研究，使该酶对有机磷酸酯的特异性提高 2000 倍。e.g2. Fong 等利用易错 PCR、DNA 改组技术，获得一个能催化非磷酸化的D-甘油醛和 L-甘油醛的进化酶。5、提高酶分子的对映体选择性运用定向进化的方法，可以提高酶的对映体选择性。e.g. Arnold 等运用易错 PCR 和饱和诱变的方法，使一株倾向于 D 型底物的8乙内酰脲酶发生转变，使之变得倾向于 L 型底物6、创造新的酶活性利用定向进化的方法改造酶，使其具有新的特异性和活性。定向进化可以补充不够理想的合理设计，创造出具有全新功能的新酶。e.g. Fersht 等将吲哚-3-甘油磷酸合成酶中 / 桶蛋白支架进行氨基酸替换，再通过两轮 DNA 改组和 StEP 重组，得到一个突变体，它具有磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的活性，比野生型的高 6 倍，但不具有合成