凋亡的双向调节机制

1、    凋亡的双向调节机制        细胞凋亡的基本过程大致包括刺激期、信号传递期、效应期（人类效应物半胱氨酸蛋白酶类总称caspases）及死后期。在从线虫到人类不同有机体细胞凋亡的前几期研究中逐步认识到，凋亡的发生是细胞受促进性和抑制性双向因素共同调节的结果，已发现凋亡的双向调节机理分述如下。 一、含死亡区分子的作用在凋亡的刺激期，细胞接受的刺激因素包括各种细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、FasL、干扰素（IFN）-、白细胞介素（IL）-6，某些生长因子如神经生长因

2、子（NGF）、内皮生长因子（EGF）、血小板源生长因子（PDGF）等，这些因子大多是通过含死亡区分子启动、调节凋亡反应的。含死亡区分子大致有两类：死亡受体及连接(adaptor)分子1。前者是存在于细胞膜上、能与相应细胞因子等配体结合的受体，如Fas、TNF-R1、DR3(Apo-3)、DR4(Apo-2)、神经生长因子受体等，这些受体的胞质段含有一大约由70个氨基酸组成的死亡区（death domain，DD）；后者是指存在于胞质中、能连接细胞膜死亡受体及有关caspase、调节凋亡信号传递的中介蛋白。已发现的连接分子有：Fas 相关死亡区蛋白（FADD）、TNF-R1相关死亡区蛋白（TRA

3、DD）、受体反应蛋白（RIP）2、RAIDD(RIP-associated Ich-1/CED-3-homologous protein with death domain)3、TNF受体相关因子（TRAF）4等，这些蛋白质分子的羧基端也均含有DD，其氨基端可含有与某些caspase的主要区段相似的氨基酸顺序，又称死亡效应区(death effector domain,DED)。连接分子依靠其分子内与其他蛋白质分子共有的DD或DED，与这些蛋白质分子相互结合，形成异源双体(heterodimer)，这种双体分子是凋亡信号传递的结构基础。近来又发现一种能与这种双体分子相关（连）的蛋白质分子FLI

4、CE(FADD-homologous ICE/CDE-3-like protease，又称caspase-8),其氨基端含有两个与FADD中DED相似的串联区段，而羧基端含有与caspase相似的260个氨基酸区段。通过这些含死亡区分子及FLICE，既可传递凋亡信号，又可阻止凋亡信号，双向控制凋亡的发生1，2。如Fas与其配体结合后，Fas的DD与FADD的DD相互作用形成异源双体，同时又因FADD的氨基端DED与FLICE 的DED相似而相互结合形成另一异源双体，继而依靠FLICE羧基端260个氨基酸区段激活caspase,引起凋亡。又如TNF与 TNFR(P55)结合后，TNFR的DD 先

5、与TRADD的DD形成异源双体，然后再依靠TRADD的DD与另一连接分子FADD 的DD 形成又一异源双体，最后由FADD的氨基端DED与FLICE的DED再形成一异源双体，使FLICE的caspase区段激活 caspase，引起凋亡2，5；但TNFR的DD与TRADD的DD形成异源双体后除了以上述方式促进凋亡信号外，还可通过TRADD的氨基端部分直接与TRAF2相互作用激活NF-B转录因子，抑制凋亡信号；说明同样TNF刺激，在TNFR与TRADD结合后，下游不同连接分子的参与，使信号传递出现分叉支路即TNFTRADDFADD凋亡及TNFTRADDTRAF2激活转录因子，解释了TNF刺激可出

6、现两种不同生物学效应的机理6。某些凋亡抑制剂，也是通过含有死亡区分子及FLICE阻断凋亡信号的传递，如主要在肌肉和淋巴组织中表达的FLIP（FLICE-inhibitory protein），有长短两型即FLIPL及FLIPS，FLIPL除了象FLIPS氨基端有两个DED外，在羧基端还有caspase样区段，它们均可与FADD及FLICE结合，而FLIP与FADD的DED结合，干扰了FADD与FLICE的结合，抑制了Fas等所有死亡受体诱发的凋亡，已观察到恶性黑色素瘤中FLIPL的含量较高7。二、bcl-2族蛋白-细胞色素c的调节已知bcl-2族蛋白中，有些如Bad、Bax可促进凋亡，而另一些

7、如bcl-2、bcl-XL等则抑制凋亡，这种对凋亡的双向调节主要是通过bcl-2族蛋白中不同分子间异源双体或同源双体的形成而实现的。如Bad可与bcl-2或bcl-XL形成的异源双体促进凋亡；Bax的同源双体也可促进凋亡；Bax还可与bcl-2或bcl-XL形成异源双体，但形成的亲和力低于Bad，故这些双体如在Bad存在时，可被Bad替代而释出Bax，替代后的双体及释出Bax形成的同源双体均促进凋亡，如在bcl-2或bcl-XL过量存在时，阻止Bax同源双体的形成，抑制凋亡；bcl-2与bcl-XL形成的异源双体也抑制凋亡8。进一步发现，bcl-2分子内有一丝氨酸易变环（flexible lo

8、op domain）,在磷酸酶抑制剂等刺激后，bcl-2中丝氨酸磷酸化而使bcl-2灭活，反而促进凋亡。Bad分子内除了有丝氨酸易变环外，还含有一段依赖磷酸化而识别14-3-3蛋白（一种能与信息酶如Raf-1相互作用的蛋白）的氨基酸顺序，如FL5.12造血细胞在生长因子IL-3作用后，可将Bad的丝氨酸残基磷酸化，磷酸化的Bad可识别、结合14-3-3蛋白，定位于胞质中，不再与线粒体膜上的bcl-XL结合成双体，反而防止凋亡；如在IL-3生长因子撤离后，Bad去磷酸化，非磷酸化的Bad又可与bcl-XL结合，促进凋亡。这些结果表明，生长因子可通过诱发Bad磷酸化，引起Bad与14-3-3蛋白结

9、合，使Bad/bcl-XL异源双体分离，抑制凋亡信号，相反，生长因子的撤离，通过磷酸酶等作用，使Bad去磷酸化而与bcl-XL结合成双体，促进凋亡8。为了弄清bcl-2族双体的作用方式，还发现：大多数bcl-2族蛋白的羧基端有疏水性跨膜区，依靠该区将这类蛋白质主要定位在线粒体外膜（或内质网、核膜），仅Bad无跨膜区，故属非膜结合蛋白；在蛋白激酶抑制剂staurosporine诱发的人HeLa细胞凋亡中，既有胞质中细胞色素c的明显增加，又有线粒体中细胞色素c的相应降低；另外，凋亡时由线粒体释放的细胞色素c还可促进caspase的激活，均说明线粒体及其细胞色素c在调节凋亡过程中起重要作用。进一步观

10、察到，bcl-2在人粒细胞性白血病HL-60细胞中的过度表达可阻止线粒体将细胞色素c释放到胞质中，同时抑制凋亡；在一种蛙卵胞质的凋亡研究系统中，线粒体可自动释放细胞色素c，并激活caspase导致凋亡核的形态变化，而将外源性重组bcl-2加入这一系统，也可防止线粒体释放细胞色素c，继而防止caspase激活及凋亡核变化；均说明bcl-2族蛋白可能通过影响线粒体释放细胞色素c的过程来调节凋亡9。关于bcl-2族蛋白影响线粒体释放细胞色素c的机制，可能为：（1）Bax可结合到一种能调节线粒体膜通透性的蛋白通道称通透性变换孔复合物，并在腺嘌呤核苷酸移位剂的协作下，增加线粒体膜的通透性10；（2）根据

11、线粒体内膜质子泵F0F1-ATP酶不同亚单位的突变可抑制Bax诱发的凋亡，而用抑制F0F1-ATP酶活性的寡霉素处理也可抑制Bax诱发的凋亡，说明F0F1-ATP酶对Bax诱发凋亡是必须的,由于Bax及bcl-2均构成膜孔，F0F1-ATP酶位于线粒体内膜，细胞色素c位于线粒体的膜间隙，可能Bax与F0F1-ATP酶间相互作用影响线粒体膜上离子的转运，造成细胞色素c从线粒体膜间隙释放到胞质11。凋亡研究还表明，线虫死亡基因ced-4的产物CED-4也是凋亡的双向调节物。它一方面通过其分子内具有ATP酶活性、能结合磷酸的环状结构促进CED-3（或caspase）的自身激活（auto-activa

12、tion），可引起凋亡12，另一方面也可直接与CED-9（或bcl-XL）结合，并被CED-9从胞质定位到膜结构上，而阻止凋亡13。已在人HeLa细胞中鉴定了一种CED-4的相似物称凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）,其作用是与细胞色素c结合后活化caspase-3,导致凋亡14。三、细胞网络信号的调节1分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）类信息通路：每条通路常包括MAPK、MAPKK（MAPK的激酶）及MAPKKK（MAPKK的激酶）3种蛋白激酶组成，首先由MAPKKK磷酸化激活MAPKK，活化的MAPKK磷酸化激活MAPK

13、，激活的MAPK移至核内，再磷酸化激活一些作为转录因子的核蛋白，使细胞外刺激与DNA的转录调节过程间形成联络信号。目前已在哺乳类鉴定了细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、应激激活的蛋白激酶（SAPK）或称JNK(Jun N-terminal kinase)及P38(与hog基因产物有关)3类MAPK15。已发现由多种生长因子激活的ERK促进细胞增生、阻止凋亡，而紫外线、热休克、高渗透压等及TNF、IL-1等细胞因子激活的SAPK及P38促进凋亡、阻止细胞生长。如在大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞的培养中，神经生长因子的加入，可激活ERK，并使细胞在914 d后分化为交感神经节样细胞；而在神经生长因子

14、撤离后6 h，分化细胞中SAPK及P38活性升高，并有凋亡的形态变化；然而，仅有SAPK或P38的激活未必引起凋亡，因IL-1是PC-12细胞产生SAPK或P38的强激活剂，但未能引起凋亡，提示神经生长因子的撤离，不仅激活SAPK及P38，还可能影响ERK的活性；定量分析神经生长因子撤离后细胞内ERK（包括P42及P44）的含量，结果ERK量明显降低，说明凋亡的发生，除了有SAPK及P38信息分子的激活外，还必须有ERK信息分子的抑制。同样，在促进PC-12细胞生长分化过程中也既有ERK的激活，又有对SAPK及P38的直接或间接抑制。因此，这类细胞无论凋亡或生存均须MAPK信息系统的双向调节1

15、6。2神经酰胺类信息分子：神经鞘磷脂是细胞膜外侧的重要组分，在适当酶的作用下，神经鞘磷脂?神经酰胺?鞘氨醇?1-磷酸鞘氨醇。现认为，神经酰胺及1-磷酸鞘氨醇分别是促进及抑制凋亡的重要信息分子。如发现FasL、TNF-与其受体结合后，可激活神经鞘磷脂酶，使神经鞘磷脂降解为神经酰胺，而用神经鞘磷脂酶处理人HL-60、U937白血病细胞后，细胞内神经酰胺增高的同时，细胞发生凋亡，说明FasL、 TNF-引起的凋亡过程中有神经酰胺的参与；又因抑制FasL、TNF-引起细胞凋亡的蛋白激酶C在这些细胞中可激活鞘氨醇激酶，导致细胞内1-磷酸鞘氨醇的积聚，而用1-磷酸鞘氨醇处理上述2种细胞，即可阻止神经酰胺引

16、起的凋亡，说明1-磷酸鞘氨醇是蛋白激酶C抑制FasL、TNF-诱发凋亡的介质；进一步发现，TNF-还降低鞘氨醇激酶的活性，蛋白激酶C还阻止TNF-诱导神经酰胺。这些结果均表明，TNF-及蛋白激酶C两类因素对细胞内无论神经酰胺或1-磷酸鞘氨醇量的变化有双重调节作用，即TNF类细胞因子可激活神经鞘磷脂酶，抑制鞘氨醇激酶，使细胞内神经酰胺升高，促进凋亡；而蛋白激酶C及PDGF等可激活神经酰胺酶及鞘氨醇激酶，抑制TNF诱导神经酰胺，使细胞内1-磷酸鞘氨醇升高，抑制凋亡。因此，细胞凋亡与否是细胞内神经酰胺及1-磷酸鞘氨醇二者共同作用的结果，很可能不同组织类型的细胞内具有特定的神经酰胺/1-磷酸鞘氨醇比，

17、各种细胞受不同的环境刺激而调节其神经酰胺/1-磷酸鞘氨醇之比，以决定其存亡的命运17。进一步用神经酰胺刺激U937、BAE等细胞，细胞内SAPK量比对照组增加40 倍，用1-磷酸鞘氨醇刺激NIH3T3等细胞，可激活其ERK信号反应；相反，神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇还分别可抑制ERK和SAPK/JNK信号，表明神经酰胺类信息分子与MAPK信息系统均以双向调节的方式从前后二步控制凋亡18。3STAT蛋白：STAT（signal transducer and activator of transcription）蛋白是一类既参与胞质中信号转导又能激活核内DNA转录的双重功能分子。许多生长因子或细胞因子

18、如EGF、IFN能通过激活蛋白质酪氨酸激酶等再激活STAT，导致基因表达，调节某些细胞生长增生，也可调节另一些细胞的凋亡。如用EGF或IFN-处理A431、乳腺癌MDA-MB-468等细胞，均可激活STAT，而活化的STAT既可激活caspase-1基因的表达，促进凋亡，又可引起细胞周期蛋白（cyclin）抑制剂P21的表达，阻止生长。因此，STAT也是从正负双向调节凋亡19。四、结语以上资料表明，在凋亡反应的多个环节中均存在对细胞凋亡的促进与抑制双向调节机理，而促进凋亡的因素必然抑制细胞生存。可以认为，细胞的凋亡与生存均是受双向因素平衡调节的结果。因此，凋亡的双向调节机制与细胞生存（包括增生

19、、分化、癌变）的机制密切相关，在凋亡与细胞生长、分化、癌变关系的研究中，既要重视促进性因素的影响，也不可忽视抑制性因素作用，同时探索二者在凋亡相关疾病中的作用具有十分重要的临床意义。（本文编辑：常秀青）作者单位：张平（310053 杭州，浙江中医学院病理学教研室）参考文献1，Peter ME, Heufelder AE, Hengartner MO. Advances in apoptosis research. Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:12736-12737.2，Fraser A, Evan G. A license to kill. Cell,19

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23、mitochondria blocked. Science,1997,275:1129-1132.10，Marzo I , Brenner C , Zamzami N , et al. Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis. Science,1998, 281:2027-2031.11，Shaham S, Shuman MA, Herskowitz I. Death-defying yeast identify novel apoptosis gen

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