氯化三乙基锡对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

1、氯化三乙基锡对体外培养大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响【摘要】目的讨论氯化三乙基锡(TET)对体外培养大鼠6脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法采用TT法检测0.5，1.0和2.0l/LTET对体外培养大鼠6脑胶质瘤细胞作用24h和48h后细胞增殖的影响、HE染色细胞形态学观察0.5，1.0和2.0l/LTET对体外培养大鼠6脑胶质瘤细胞作用48h后细胞增殖和形态学变化。采用透射电镜观察0.5，1.0和2.0l/LTET作用6细胞48h后的超微形态学变化。采用荧光原位末端标记方法检测细胞凋亡。结果TT法及HE染色细胞形态学观察均显示0.5，1.0和2.0l/LTET在体外均可抑制6细胞增殖，

2、6细胞增殖率存在着剂量依赖性和时间依赖性降低趋势;HE染色和透射电镜可观察到6细胞凋亡的形态学变化。荧光原位末端标记方法检测到细胞凋亡率存在剂量依赖性上升趋势。结论TET可抑制体外培养大鼠6胶质瘤细胞增殖，其机制可能主要与6细胞凋亡有关。【关键词】三乙基锡化合物;TT法;6脑胶质瘤;增殖;凋亡【Keyrds】Triethyltinpund;TT;6glia;Prliferatin;Apptsis寻找易透过血脑屏障且有效的抗胶质瘤药物是亟待解决的问题。氯化三乙基锡(TET)是中枢神经系统毒物，具有脂溶性，易透过血脑屏障。关于TET治疗脑胶质瘤国内外尚未见报道。本实验旨在研究TET对体外培养大鼠6

3、胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响，为治疗胶质瘤提供理论根据。1材料与方法1.1材料氯化三乙基锡TET(AlfarAesar美国)，四甲基偶氮唑盐TT(Siga)，二甲基亚砜DS(Siga)，ID细胞培养基(Gib)，胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)ApAlertTDNAFragentatin检测试剂盒(BDbisiene)。1.2方法1.2.1细胞培养6胶质瘤细胞株(购自上海细胞所)，为贴壁细胞。6胶质瘤细胞在含有10%胎牛血清的ID培养基中，置于37，5%2培养箱培养。用0.25%胰酶(PBS配)消化传代，传代浓度为5105/l，传至3代后用于实验。1.2.3HE染色观察TET对6细胞增殖

4、和凋亡的影响将接触0l/LTET(生理盐水对照组)，0.5，1.0及2.0l/L(实验组)TET48h后的6胶质瘤细胞行HE染色，观察细胞密度及形态，并拍照，放大倍数为100倍。1.2.5荧光原位末端标记方法检测细胞凋亡率将盖玻片放入6孔培养板中，按每孔5105个细胞接种于6孔培养板中,待细胞贴壁后，参加TET至终浓度分别为0l/L(生理盐水对照组)，0.5，1.0，2.0l/LTET(实验组),细胞继续培养48h后，按ApAlertTDNAFragentatin检测试剂盒步骤进展实验。结果断定：激光共聚焦显微镜下观察，计数凋亡细胞。所有细胞在620n激发光下，细胞胞浆呈现强红色荧光，凋亡细胞

5、在(52020)n激发光下，呈现强绿色荧光，在(52020)n及620n激发光下呈现强黄色荧光。镜检并计数：显微镜下在同一放大倍数下计数，计数10个不同视野的凋亡细胞数和细胞总数，计算凋亡细胞百分率。1.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件包进展数据统计学分析，采用方差分析，所有数据均以xs表示。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1TT比色法检测不同浓度TET对6胶质瘤细胞增殖的影响0.5，1.0和2.0l/LTET作用6细胞24h和48h后细胞增殖率分别为92.06%，90.48%，80.95%和84.34%，63.83%和58.04%，细胞增殖率显示出剂量依赖性和时间依赖性降低趋势。见表

6、1。表1不同浓度TET作用6胶质瘤细胞24h、48h对其增殖的影响与对照组比拟：1)P0.05;与0.5l/LTET组比拟：2)P0.01;与1.0l/LTET组比拟：3)P0.012.2HE染色观察TET对6细胞增殖和凋亡的影响HE染色可见对照组6细胞形状不规那么，呈梭形或多角形，细胞生长密集，细胞浆呈粉红色淡染，核呈蓝色淡染，2.0l/LTET实验组可见细胞体积变小,生长密度降低。局部细胞收缩变成圆形，呈散在分布，胞浆浓缩深染，细胞核染色质致密浓缩，蓝黑色深染，也可见到核碎裂，呈凋亡形态学改变(图1)。0.5，1.0l/LTET组和对照组相比也出现了细胞密度降低，细胞收缩变小，胞浆浓缩深染

7、，细胞核浓缩深染，也可见到核碎裂，呈凋亡形态学改变。2.3透射电镜观察TET对6细胞超微构造的影响采用透射电镜观察0l/LTET(生理盐水对照组)，0.5，1.0，2.0l/LTET(实验组)作用6细胞48h后，6细胞的超微构造变化。对照组6细胞体积大，瘤细胞形状不规那么，细胞外表可见排列紊乱的微绒毛，绒毛较多且长短不一。细胞核形状不规那么，有核切迹，核内染色质分布均匀。胞质内线粒体及粗面内质网等细胞器可见。实验组可见6细胞体积变小，胞浆浓缩，细胞外表微绒毛减少、消失，核内染色质边集，位于核膜下，显示早期凋亡改变(图2)。2.4荧光原位末端标记方法检测细胞凋亡率低中高浓度TET作用于体外培养6

8、胶质瘤细胞48h，凋亡细胞百分率分别为(8.732.03)%、(24.182.57)%、(30.671.58)%，与对照组(4.830.65)%比拟以及各剂量组间比拟均有显著性差异(P0.050.01)，凋亡细胞百分率随TET药物浓度的增加而升高,存在着剂量依赖关系。3讨论脑胶质瘤是神经系统最常见的原发性肿瘤,目前手术治疗为首选，但手术会导致相应部位神经功能损害，且剩余的浸润性肿瘤细胞会导致术后肿瘤复发1。脑胶质瘤治疗后复发快，死亡率高,如何有效治愈胶质瘤一直是亟待解决的课题2，3。化疗是胶质瘤治疗的重要手段，但药物透过血脑屏障仍是胶质瘤化疗的一个难题。从众多的抗肿瘤药物中挑选出更易于透过血脑

9、屏障的药物，或研制出更具杀伤力的化疗药物，是胶质瘤化疗的重要研究方向4。TET是中枢神经系统毒物，具有脂溶性，易于透过血脑屏障，脑组织是它的靶器官，那么TET就有可能抗胶质瘤增殖而发挥抗脑胶质瘤作用。国外学者研究说明6胶质瘤细胞对三乙基锡的敏感性高于人神经元和星型细胞、大鼠星型胶质细胞和小脑颗粒细胞57。我们利用肿瘤细胞和正常细胞对毒物敏感性不同这一特点，给予胶质瘤细胞敏感性毒物，从而到达治疗胶质瘤，同时又不损害正常脑组织的目的。目前TT比色法广泛用于临床前抗癌药物挑选的研究8。本实验采用TT法检测TET对6细胞增殖的影响，结果发现0.5，1.0及2.0l/LTET作用于体外培养的6胶质瘤细胞

10、24h和48h，可降低6胶质瘤细胞增殖率，并有剂量依赖性及时间依赖性降低趋势。HE染色观察不同浓度TET作用6细胞48h后6细胞形态变化及细胞生长密度情况，对照组6细胞生长密度大，细胞数目多，有些部位细胞生长密集，并有交织成团的趋势;TET实验组6细胞生长密度降低，细胞数目出现不同程度的减少，细胞出现不同程度的体积变小，此种表现同TT法检测结果相一致，均显示出TET对6细胞增殖抑制作用。同时还可见到TET实验组局部6细胞收缩变成圆形，呈散在分布，胞浆浓缩深染，细胞核染色质致密浓缩，蓝黑色深染，也可见到核碎裂，呈凋亡形态学改变。透射电镜检测发现TET实验组6细胞体积变小，胞浆浓缩，细胞外表微绒毛减少、消失