分子标记辅助选择Pigm基因改良水稻品种合美占的稻瘟病抗性

分子标记辅助选择Pigm基因改良水稻品种合美占的稻瘟病抗性摘要：Pigm是一个广谱持久的已克隆的抗稻瘟病基因，本论文研究利用Pigm基因的DNA序列设计功能进行标记，设计了显性DNA标记DG-2,以谷梅4号为Pigm基因供体亲本，通过分子标记辅助选择技术进行连续回交育种，改良优质常规稻合美占的稻瘟病抗性。经过连续多代回交和自交并对得到的后代进行选择，最终获得带有Pigm基因的抗稻瘟病水稻群体BC3F2，从该群体中随机鉴定的13个单株中有11个带有Pigm基因的单株，继续自交直到得到纯合抗病体系。关键词：稻瘟病抗性；Pigm基因；分子标记辅助选择育种;合美占前言水稻稻瘟病水稻(Oryzasativa)是禾本科稻属植物，同时也是世界上最重要的粮食作物之一，稻米是全球多数人的主食。稻瘟病又称稻热病，是由子囊菌侵染所导致的一种常见且危害巨大的水稻病害，一旦发生则会造成水稻大部分减产甚至绝产，也会造成非常严重的经济损失REF_Ref500962789\r\h\*MERGEFORMAT。禾谷镰Magnaporthegrisea是一种真菌性病菌，是稻瘟病的病原菌REF_Ref500962796\r\h\*MERGEFORMAT。根据研究人员所统计的大量数据表明，由水稻稻瘟病所引起的产量损失，全球高达1.5亿吨左右REF_Ref500962808\r\h\*MERGEFORMAT。稻瘟病是一种一旦发病就无法采取各种措施补救的病害，发病时就连研究人员也根本无法控制，会加重水稻大量减产的情况，如果采取药物控制的方法则会加大水稻的生产成本，加重农民的经济负担，与此同时还会污染周围的环境REF_Ref500962816\r\h\*MERGEFORMAT。因此，解决水稻稻瘟病问题是迫在眉急的。目前通常采用化学药物控制或种植稻瘟病抗性品种等方法来防治稻瘟病的发生。其中利用化学药物控制的方法，主要做法是对种子时期、幼苗时期、植株时期等不同水稻器官部位喷施不同浓度不同种类的化学试剂，根据发病的情况和品种的特性合理使用适量的化学试剂，这种做法既会造成环境的污染，又会增加大量的劳动力，并且耗时长，花费较高。研究人员经过长期的研究实践表明，目前治疗稻瘟病最合理最有效的方法就是选育和种植抗病品种，既不会造成环境污染，又会减轻经济负担，并且效果也十分的显著。REF_Ref500962828\r\h\*MERGEFORMAT然而传统的培育抗稻瘟病品种的方法所需周期过长，稻瘟病遗传背景又十分的复杂，生理小种变异的速度非常快，一个新品种在推广可能在短短几年以内就失去它本身具有的抗性REF_Ref500962836\r\h\*MERGEFORMAT。传统抗病育种的方法只针对质量性状的选择是有效的，在对数量性状或质量一数量性状的选择上面有很大的区别，因为基因之间的关系复杂，易引起个体的基因型与表现型之间的差异，所以传统育种方法的准确性相对较差REF_Ref500962849\r\h\*MERGEFORMAT。通过现代分子育种技术，能够在每个世代对目标性状进行单株选择，同时也可以对轮回亲本的遗传背景进行选择，具有可靠、高效等优点，且不存在生物安全性的相关问题，进而在实践中得到了大家更多关注和应用REF_Ref500962859\r\h\*MERGEFORMAT。稻瘟病研究进展日本在20世纪60年代的时候使用经典遗传学的方法，鉴定出了最初始的8个抗性位点上的14个基因，建立了一套用于抗稻瘟病基因分析的鉴别体系（JDCs，Japansedifferentialcultivars），之后开始展开世界范围的稻瘟病抗性遗传研究的系统化。到目前为止，通过广泛大量的遗传分析，已鉴定了101个抗稻瘟病的抗性基因，仅第6号染色体短臂端着丝点区域的Pi2/9基因簇内就至少定位了11个抗稻瘟病基因（Pi2、Pi2-2、Pi9、Piz、Piz-t、Pigm、Pi22、Pi26、Pi40、Pi42、Pi50）REF_Ref466108790\r\h\*MERGEFORMAT,并且在该位点的这些基因都具有广谱抗性。Pigm基因是谷梅4号第6号染色体短臂端Pi2/9位点上一个显性广谱持久抗瘟基因，和其他抗瘟基因如Pil,Pit,Pi3等相比，Pigm基因的抗菌谱更广，抗瘟性更强.很多育种单位常常采用光谱抗性持久的已克隆的Pigm来改良水稻稻瘟病的抗性，都得到了很好的结果。运用Pigm基因改良武运粳29196稻瘟病抗性，结果表现出高抗的效果；REF_Ref501046322\r\h\*MERGEFORMAT根据Pigm与Pi2和Pi9等位及紧密联锁的结果，结合分子标记辅助选择育种的方法对金23B水稻瘟病抗性进行改良，最终得到了抗稻瘟病的保持系金23BREF_Ref501046423\r\h\*MERGEFORMAT；梁毅等REF_Ref501046548\r\h\*MERGEFORMAT根据Pigm精细定位结果在各后代株系稻瘟病抗性和轮回亲本相比都有大幅度的提高。田红刚等REF_Ref501046814\r\h\*MERGEFORMAT人则是将谷梅4号品种的Pigm基因导入到粳稻品种空育131，龙粳26和垦鉴稻6中，导入Pigm基因的品种对水稻稻瘟病菌的抗性方面有很多的改善。结果说明Pigm基因具有良好的使用价值。对于传统的水稻抗病育种来说，则对水稻育种者要求十分严格，对于稻瘟病的病原菌只采用自然诱和室内人工接种的方法，会导致其鉴定结果不够精准，选择效率低，并且容易导致抗性基因的丢失。通过现代分子育种，从而在选择效率方面有很大的提高，缩短了育种的周期。本研究是采用有性杂交与现代分子生物技术—分子标记辅助选择相结合，将具有广谱持久抗性基因Pigm渗入到易感稻瘟病水稻品种合美占中，定向改良合美占的稻瘟病抗性。研究内容与目的意义本研究以谷梅4号为供体亲本，优质常规稻品种合美占为受体亲本，利用已克隆的稻瘟病广谱抗性基因Pigm的特异标记，进行分子标记辅助选择育种，定向改良优质常规稻品种合美占的稻瘟病抗性，培育优质抗病广适型水稻新品种。材料与方法供试材料广谱持久抗稻瘟病Pigm基因供体亲本谷梅4号；Pigm基因的受体亲本及轮回亲本合美占；合美占/GM4的BC3F2群体；感稻瘟病对照水稻品种日本晴和CO39。方法分子标记的建立利用已有的基于广谱抗稻瘟病基因Pigm的连锁分子标记（表1），筛选高效多态性分子标记，用以分析该标记在谷梅4和合美占之间的多态性及其基因型辅助选择效率，并用于合美占的MAS育种实践。表1与Pigm基因紧密连锁的供试分子标记序列Table1ThesequencesoftestedmolecularmarkerswhichtightlylinkedtoPigmgene引物名称上游序列（5’-3’）下游序列（5’-3’）productssize在Nipponbare基因组序列上的位置PC22705CTAGCCTTCCGTCCTGTGGAACTGCCCTTTCCCTCT99410373822-10374815S29742CAGTGAAACGAACGCTATGAATAGGAAGGGTTGATGTTG55410380859-10381312Pi9GCTGTGCTCCAAATGAGGATGCGATCTCACATCCTTTGCT39710373952-10374348GM4-1TTGTGACTGTTTGGTTTGCTCTTGTTATTTTGCTGCT30610385938-10386243GM4-2TCAGGGAATCTTCAATGTCTCTTGTTATTTTGCTGCT68110385938-10386618DG-1TCTGACTCGGAGGGACATACAGTGCGTAAAGGTTGG218910389676-10391864DG-2GAGACGCAGGAACAGGGTGCCGAGTGGCTGAGCAACAA78210392571-10393353T7ECCATCCCATCTGAAACCATGCCCCCCAGGTCGTGATACCTTC163910387643-10389281T7E2bCAACAAACGGGTCGACAAAGGCCCCCAGGTCGTGATACCTTC64210388640-10389281T8E3CGCGGTAACTGACAGCAAAGCCGATCGTCAACGTCCACAGG77910397447-10398225T8I12CCATGTAGCGTACCATGACAGCAAGGGAAGGGGATTGGGAATTT62310396464-10397086T9E3CGAATGGTGGGCCTGTTGTAGGCATGGTTTCAGATGGGATGG92610407213-10408138T9E4CAGAGCAGTAACAAACCCTATCCGCAAGATCAACATTC79310407012-10407804T9E5CACCCTTGGATGGCGATGTTTCCGAGTGGTTATTACTATTTG64310407147-10407789T9I1TCTAGGATGGCAAAGGCGTCTCGGGAGAGGGTCATAGCTCGACA84210405144-10405985C0248AAGGTTCTCGTGGTTTCATCCCCATTGTTTATAGCAG68210421545-10422226T10I2ATGGGCTCTTACGCGAACTCCTGGGGATGTCGAGAGCAACTC62710421300-10421926AP5659-3TCTTTCCTAGGGAACCAAAGAAGTAGTTGCTGAGCCATTG22910406597-10406825C5483GGGAGGAGGAATGGTAGGAATTAGGCTGCTTGTCTTGGG46810367284-10367751PB9-1TAGACTCCTTCCAAGTTTGACTTGTGATTTTCAGAATTTTCG10368027田间病圃表型鉴定供试水稻种子经短时间日晒（打破休眠）后，用白色羊皮纸袋分装成约100粒每袋，经35-36℃热水浸泡24小时（期间保持水温恒定并换水3-4次，每次都要沥干水分后再浸泡以免种子发酵而影响发芽率），之后降水沥干并用湿毛巾保湿在35度条件下进行催芽，经24-48小时待水稻种子破胸后分别播种于浏阳大围山天然稻瘟病病圃，周围播种感病诱发水稻品种CO39，实行常规水稻管理但不打农药。待到水稻苗长到3叶时将带有稻瘟病生理小种的枯草或稻草粉碎后均匀接种于诱发品种CO39上，一两个星期后进行观察统计，分析供试水稻材料的苗瘟发病情况。模板DNA及标记基因型鉴定采用改良CTAB法，具体步骤如下：(1)选取需要鉴定基因型的植株单株，取0.2g幼嫩的叶片置于2.0ml已灭菌的离心管中，该样品离心管保存与冰盒；(2)向样品中注入液氮，用磨样机磨成粉末；(3)向磨好的样品离心管中迅速加入500-600μLCTAB提取液，振荡器振荡后用65℃烘箱温浴30min，其间振荡2-3次；(4)加入700μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液，振荡器充分振荡摇匀，放入离心机中12000rpm离心10min，再用移液枪将上清液转移至另一灭菌的1.5ml离心管中；(5)在上清液中加入等体积的-20℃预冷异丙醇，上下颠倒轻微晃动，直至产生絮状物，-20℃冰箱放置20min，再以12000rpm离心10min；(6)将上清液倒掉，只留白色沉淀于离心管，加入500μL70%的乙醇溶液，清洗一次，使白色沉淀漂浮于液体中；(7)以12000rpm离心3min，将上清液倒去，留于管底的就是所需DNA，自然晾干约10min；(8)加入100-200μL含有1%RNase的TE缓冲液，充分溶解后，4℃冰箱保存。基因型鉴定采用常规PCR反应和琼脂糖凝胶电泳来鉴定。PCR反应体系（10μL）：DNA模板（约100ng/μL）1.0μL，5U/μLTakararTaq酶0.1μL,2.5mMdNTPs0.2μL,10pmol/μLprimerpairs各0.5μL,10×Buffer(含mg)1.0μL，ddH2O6.7μL。PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃50s变性，55℃50s退火，72℃60s延伸，35个循环；72℃终延伸7min。MAS育种技术路线以谷梅4号为Pigm基因供体亲本，合美占为受体及轮回亲本。确定多态性分子标记后，与谷梅4号杂交以及与目标杂合单株逐代回交。通过分子检测、结合田间农艺性状综合考察等手段构建回交群体；回交群体代数达到BC3F1的组合，通过同样手段筛选出抗稻瘟病单株后分单株套袋自交，经过自交得到BC3F2自交群体。技术路线如下：合美占X谷梅4↓苗瘟鉴定F1X轮回亲本↓苗瘟鉴定，分子检测，阳性植株杂交BC1F1X轮回亲本↓苗瘟鉴定，分子检测，阳性植株杂交BC2F1X轮回亲本↓苗瘟鉴定，分子检测，阳性植株自交BC3F1X轮回亲本↓eq\o\ac(○,X)农艺性状分析BC3F2→BC3Fn图1Pigm基因MAS回交育种技术路线Fig1ThePigmgenebackcrossbreedingtechnicalroutebyMASMAS育种群体构建Pigm基因供体亲本谷梅4号，Pigm基因受体亲本以及轮回亲本合美占，在2016～2019在长沙与三亚之间进行MAS育种，现已获得BC3F2群体，通过单株标记基因型鉴定获得含有Pigm基因（位点）的BC3F2株系。关于MAS育种群体的构建，每一代在田间种植30株左右，当水稻处于分蘖期时按照单株编号提取叶片的样本DNA，然后根据标记基因型的鉴定结果和田间农艺性状选择13个单株左右再进行回交与自交，最后混合收种。结果与分析分子标记的多态性分析及基因型鉴定在水稻分蘖期随机取样13份、编号、提DNA进行分子鉴定，根据Pigm基因的启动子序列设计和筛选了1个特异DNA标记DG-2。DG-2为显性分子标记，在两亲本间多态性明显且稳定。经过基因型分析结果（图2）显示：分子标记DG-2在供体亲本GM4（1）为一条782bp的扩增条带，受体亲本合美占（2）没有扩增条带，在合美占×GM4BC3F2群体中，可以看出有11个单株（3，4，5，6，7，8，9，12，13，14，15，抗病类型）带有一条扩增条带大约782bp，有2个单株（10,11，感病类型）没有扩增条带。由此可见，DG-2可以有效区分BC3F2群体中的2种不同基因型。筛选出的11个抗病单株已经自交获得BC3F2株系，将在此基础上继续鉴定筛选抗病纯合体，培育抗病水稻新品系。图2分子标记DG-2对合美占/GM4的BC3F2群体的基因型鉴定Fig.2GenotypeidentificationofmolecularmarkerDG-2toBC3F2populationofHemeizhan/GM4供试水稻材料的稻瘟病抗性各供试材料田间抗性结果如图3所示。对照组材料CO39为高感品种，广谱持久抗稻瘟病Pigm基因供体亲本谷梅4号为高抗品种，受体亲本合美占为感病品种以及合美占/谷梅4号BC3F2群体。供体材料谷梅4号表现出来的抗稻病性占有一定的优势，秧苗叶片表现为抗病；合美占稻瘟病抗性差，秧苗叶片表现为感病；合美占/谷梅4号BC3F2群体表现为抗性分离；改良中的合美占的抗稻瘟病的抗性有所改善。对照组材料CO39表现出来的抗性最差，从图可以明显的看出来它的苗瘟患病最重。结果表明我们对合美占稻瘟病抗性的改良效果十分明显。CO39谷梅4号合美占合美占/谷梅4号BC3F2群体图3田间病谱水稻苗瘟的鉴定Fig.3Identificationofseedlingriceblastresistancinfieldnursery结论水稻的稻瘟病是水稻最严重的病害之一，每年都会产生大量的经济损失。目前最有效的最保守的方法就是选育抗性新品种。水稻稻瘟病采取抗病育种的方法已经有几十年的历史了，运用这种方式成功的例子有很多但绝大多数新品种的抗病能力只能持续一段时间，一般是在三到五年之间。病菌的基因很不稳定容易产生变异。又由于各种原因加大了育种的难度。随着分子生物学和生物技术的发展，现代技术的快速发展为基因育种提供了一个良好的环境从而缩短了育种年限并在一定程度上加快了水稻遗传育种史的发展。分子标记、转基因技术对水稻的遗传育种产生了很重要的影响，完善了水稻育种的方法。MAS育种准确、安全、高效，能够表现出独特的育种优势。本研究利用MAS技术选育出抗病纯系新品种，在原有的亲本基础上进行进一步的改良，大大的提高了水稻稻瘟病抗性。在以后的研究工作中我们更应该注意发掘新的抗性基因，利用现代科技成果寻找联系更为紧密的分子标记。与此同时研发结构更加简单，操作更加方便的功能性分子标记尤为重要，这在一定的程度上可以扩大应用范围，使之在更广阔的领域得到应用。能够同时兼抗多种病害的育种新材料也是今后研究的一个重要方向，尤其是那种抗性强抗谱广的育种材料参考文献[1]谌惠邦,邓力华,肖友伦,李锦江,肖国樱.香稻育种新材料的抗性基因与表型鉴定[J].分子植物育种,2020,18(08):2597-2605.[2]曹妮,季芝娟,曾宇翔,郑安福,方晶璟,杨长登,梁燕.定向改良超级早稻中早39稻瘟病抗性[J/OL].植物遗传资源学报:1-14[2020-05-30]./10.13430/ki.jpgr.20191219001.[3]陈庆全,丁辉,程梦瑶,王璐杨.籼型光温敏核不育系安农086S的选育[J].安徽农业科学,2020,48(02):37-39.[4]陈庆全,胡群文,程梦瑶,王璐杨.籼型水稻光温敏核不育系安农186S的选育[J].安徽农业科学,2019,47(24):51-53.[5]汤剑豪,叶胜拓,米甲明,牟同敏.分子标记辅助选择改良水稻恢复系香5的病虫抗性[J].杂交水稻,2020,35(02):60-67.[6]赵国超,王冬翼,张珍,王彤,吴雪源,曾文秀,李建粤.分子标记辅助选育含有抗稻瘟病基因和软米基因两系不育系水稻新品系[J].上海师范大学学报(自然科学版),2019,48(05):591-596.[7]田大