丝素蛋白基组织工程支架制备工艺

3丝素蛋白基组织工程支架制备工艺本文件规定了丝素蛋白基组织工程支架（以下简称“支架”）制备过程中的一般要求、工艺流程、质量控制及过程记录。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T16292医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验GB19489实验室生物安全通用要求《中华人民共和国药典（2025年版）》（以下简称《药典》）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1丝素蛋白silkfibroin从天然蚕丝中去除丝胶后得到的主要蛋白质成分，由重链、轻链及P25糖蛋白组成，具有良好的生物相容性和可降解性。3.2组织工程支架tissueengineeringscaffold模拟天然细胞外基质结构与功能，为细胞增殖、分化及组织再生提供三维空间支撑的生物材料载体。3.3冷冻干燥法freeze-dryingmethod将丝素蛋白溶液冷冻成固态后，在真空环境下升华去除水分，形成多孔支架的制备技术。3.4静电纺丝法electrospinningmethod在高压电场作用下，丝素蛋白溶液形成喷射流并固化，得到纳米级纤维支架的制备技术。3.5盐析/致孔法saltleaching/porogenmethod通过在丝素蛋白基质中添加可溶性致孔剂（如氯化钠、蔗糖等成型后去除致孔剂以构建多孔结构的制备技术。4一般要求4.1实验室及生产环境4.1.1制备过程应在符合GB19489规定的生物安全二级（BSL-2）及以上实验室或洁净度应符合GB/T16292规定，设置原料处理、蛋白提取、支架成型、灭菌包装四个独立功能区，避免交叉污染。4.1.2关键设备包括冷冻干燥机、静电纺丝机、高效液相色谱仪、扫描电子显微镜、万分之一分析天4平等，应建立校准与维护制度，校准周期不超过1年，维护记录保存期限不少于5年。4.2原材料与试剂4.2.1天然蚕丝原料天然蚕丝原料应符合下列规定。a）家蚕蚕丝/柞蚕蚕丝：纯度不低于95%，灰分不大于1.0%，无霉变、异味。b）原料来源可追溯，提供批次检测报告。4.2.2试剂试剂应符合下列规定。a）氢氧化钠（NaOH）、氯化钙（CaCl2）、乙醇等提取试剂：分析纯及以上级别，纯度不低于99.0%。b）致孔剂（氯化钠、蔗糖）：符合《药典》药用辅料标准，粒径分布50μm～300μm，D10≥50μm，D90≤300μm。c）缓冲液：采用GB/T6682规定的一级水配制，pH7.2～7.4，渗透压280mOsm/kg～320mOsm/kg，配制后24h内使用。4.3生物安全与处置4.3.1含丝素蛋白的废液应经121℃高压灭菌30min后排放，固体废弃物按医疗废弃物管理要求处置。4.3.2细胞毒性检测后的细胞废弃物应经0.5%次氯酸钠溶液浸泡1h后，再按生物危害废弃物处理。5工艺流程5.1工艺流程图丝素蛋白基组织工程支架主要制备工艺分为“丝素蛋白提取纯化”与“支架成型”两大阶段，具体流程见附录A。5.2丝素蛋白提取纯化5.2.1原料预处理原料预处理应符合下列规定。a）脱胶：将天然蚕丝剪成2cm～5cm小段，按浴比1:50（蚕丝：试剂）加入质量浓度0.5%～1.0%的NaOH溶液，在98℃~100℃水浴中搅拌脱胶30min～60min，脱胶至丝胶残留率低于5%。b）清洗：脱胶后的丝素纤维用GB/T6682规定的一级水冲洗至中性（pH6.8～7.2在60℃~70℃真空干燥箱中干燥4h～6h，得到丝素纤维。5.2.2丝素蛋白溶解丝素蛋白溶解应符合下列规定。a）按摩尔比CaCl2：无水乙醇：水=1:2:8配制溶解体系，将干燥丝素纤维按浴比1:10（丝素纤维：溶解体系）加入，在70℃~80℃恒温水浴中搅拌溶解2h～4h，形成丝素蛋白溶液。b）过滤：将溶解后的溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，去除未溶解杂质，收集澄清滤液。5.2.3透析纯化透析纯化应符合下列规定。a）将澄清滤液装入截留分子量8kDa～14kDa的再生纤维素透析袋，置于GB/T6682规定的一级水中透析，每日更换透析水3次～4次，持续透析72h以去除Ca2+、乙醇等小分子物质。b）浓度调节：透析后的丝素蛋白溶液经旋转蒸发仪浓缩（温度50℃~60℃,真空度-0.08MPa~-0.1MPa），调节浓度至5%～15%（质量分数）。5.3支架成型工艺5.3.1冷冻干燥法（适用于多孔块状支架）5T/FDSAXXXX—202X冷冻干燥法应符合下列规定。a）制模：将调节浓度后的丝素蛋白溶液倒入定制模具，液面高度控制在5mm～15mm。b）冷冻：将模具放入-80℃~-60℃超低温冰箱中预冻2h～4h，使溶液完全冻结。c）冻干：将预冻后的样品转移至冷冻干燥机，设置真空度不大于10Pa，升华温度-50℃~-40℃,升华时间12h～24h；解析温度20℃~30℃,解析时间4h～6h，得到多孔支架坯体。d）交联：将支架坯体浸泡于质量浓度5%～10%的乙醇溶液中交联2h～4h，或采用戊二醛蒸汽交联（浓度25%，温度25℃,时间1h～2h），增强支架力学性能与降解稳定性。5.3.2静电纺丝法（适用于纤维状支架）静电纺丝法应符合下列规定。a）溶液配制：在丝素蛋白溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或聚己内酯（PCL）（丝素蛋白：高分子材料质量比7:3～9:1），搅拌至完全溶解，形成纺丝溶液。b）纺丝参数设置：1）电压：15kV～25kV，纹波≤1%；2）纺丝距离（喷头至接收板）：10cm～15cm；3）溶液流速：0.5mL/h～2.0mL/h；4）接收板转速（若为管状支架）：500r/min～1500r/min；5）环境条件：温度20℃~25℃,相对湿度30%～50%。c）纺丝与后处理：启动静电纺丝机，收集纤维膜/管状支架，在60℃~70℃真空干燥箱中干燥6h~8h，去除残留溶剂；若需交联，采用甲醇蒸汽交联（温度25℃,时间30min～60min）。5.3.3盐析/致孔法（适用于高孔隙率支架）盐析/致孔法应符合下列规定。a）混合制浆：将丝素蛋白溶液与致孔剂按质量比1:2～1:4混合，搅拌均匀形成糊状混合物。b）成型：将混合物压制成型（压力0.5MPa～2.0MPa，温度25℃~30℃,时间10min～20min），或注入模具后在4℃冰箱中静置2h～4h固化。c）致孔剂去除：将成型坯体浸泡于GB/T6682规定的一级水中，搅拌洗脱致孔剂，每2h更换一次水，直至洗脱液中无Cl-（0.1mol/LAgNO32滴无浑浊），洗脱时间不少于12h。d）干燥与交联：将洗脱后的支架在60℃~70℃真空干燥箱中干燥4h～6h，再用质量浓度10%的乙醇溶液交联2h～3h。5.4灭菌与包装5.4.1灭菌：采用γ射线灭菌（剂量25kGy～30kGy）或环氧乙烷灭菌（温度30℃~50℃,湿度40%~60%，时间2h～4h），灭菌后环氧乙烷残留量应符合《药典》要求。5.4.2包装：灭菌后的支架采用无菌铝塑复合袋包装，密封后标注产品名称、规格、批次号、灭菌日期、有效期。6质量控制6.1原材料质量控制每批次原材料应进行以下检测，结果应符合下列规定。b）丝素蛋白溶液：纯度不小于90%，pH6.8～7.2，无菌。c）致孔剂：粒径分布50μm～300μm，纯度不小于99.0%。6.2中间产品质量控制6.2.1丝素蛋白提取阶段丝素蛋白提取阶段应符合下列规定。a）脱胶后丝素纤维：丝胶残留量（考马斯亮蓝染色法）不大于5%。6b）透析后溶液：Ca2+含量（原子吸收光谱法）不大于0.1mmol/L。6.2.2支架成型阶段不同成型工艺的中间产品应符合表1要求：表1中间产品要求6.3成品质量控制每批次成品应进行以下检测，结果符合表2要求：表2成品质量要求）；6.4批次一致性验证每批次成品应与对照批次（首件合格批次）进行一致性比对，并符合下列规定。a）外观、尺寸偏差一致性：差异不大于3%。b）孔隙率、拉伸强度一致性：差异不大于10%。c）细胞毒性一致性：RGR差值不大于5%。6.5稳定性验证a）外观无明显变化。b）拉伸强度下降不大于15%。c）细胞毒性RGR不小于75%。d）无菌、内毒素含量符合要求。7过程记录7.1原料预处理记录7.1.1记录内容原料预处理记录包括但不限于以下内容。a）原材料名称、规格、批次号、供应商信息。b）脱胶试剂浓度、温度、时间，清洗后pH值。c）干燥温度、时间，预处理后丝素纤维重量。d）操作人员、处理日期。7.1.2记录形式纳入原材料电子台账，每批次生成唯一编码，保存期限不少于5年。77.2丝素蛋白提取纯化记录7.2.1记录内容丝素蛋白提取纯化记录包括但不限于以下内容。a）关联原料预处理编码。b）溶解体系配比、溶解温度、时间，过滤膜孔径。c）透析袋截留分子量、透析时间、换水次数。d）浓缩后丝素蛋白浓度、pH值。e）操作人员、提取日期。7.2.2记录形式电子记录随原料预处理编码存档，保存期限不少于5年，附浓度检测原始数据。7.3支架成型记录7.3.1冷冻干燥法记录冷冻干燥法记录包括但不限于以下内容。a）关联丝素蛋白提取编码。b）溶液浓度、模具规格，预冻温度、时间。c）冷冻干燥机型号、真空度、升华温度/时间、解析温度/时间。d）交联试剂浓度、交联温度、时间。e）成型后支架尺寸、含水率。f）操作人员、成型日期。7.3.2静电纺丝法记录静电纺丝法记录包括但不限于以下内容。a）关联丝素蛋白提取编码。b）纺丝溶液配比（丝素蛋白与高分子材料比例）、浓度。c）静电纺丝机型号、电压、纺丝距离、溶液流速、接收板转速。d）环境温度、相对湿度，纺丝时间。e）纤维直径（SEM检测）、支架重量。f）操作人员、成型日期。7.3.3盐析/致孔法记录盐析/致孔法记录包括但不限于以下内容。a）关联丝素蛋白提取编码。b）致孔剂类型、粒径、与丝素蛋白质量比。c）压制压力、温度、时间（或静置温度、时间）。d）洗脱时间、换水次数，致孔剂残留量检测结果。e）干燥温度、时间，交联条件。f）操作人员、成型日期。7.3.4记录形式电子记录按成型工艺分类存档，每批次生成唯一过程编码（格式：SC+成型工艺代码+年月日+批次序号），保存期限不少于5年。7.4灭菌与包装记录7.4.1记录内容灭菌与包装记录包括但不限于以下内容。a）关联支架成型过程编码。b）灭菌方式、灭菌参数（剂量/温度/湿度/时间）。c）灭菌后环氧乙烷残留量检测结果（若为环氧乙烷灭菌）。d）包装材料类型、包装规格，密封完整性检测结果。e）成品批次号（格式：CP+生产线编号+年月日+批次序号）、入库数量。f）操作人员、灭菌日期、包装日期。7.4.2记录形式纳入成品电子台账，与原材料台账、提取/成