（病原生物学专业论文）hcap1（hccassociated+protein+1）基因功能研究.pdf

h c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 1 堪凼功能研究 p 叱摘味 中文摘要 h c a p t ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 基因是我们实验室用p a c 5 7 9 插入的d n a 片 段为探针筛选人正常肝c d n a 文库和r a c e 方法克隆到的一个新基因。为了研究 h c a p l 的生物学功能，本论文从多方面、多角度展开了对其功能的研究。 同源性比较发现，h c a p l 与c h a r r o u s 等人克隆的g e m i n 4 基因3 4 0 9 个核苷酸9 9 同源性，阅读框架一致，1 0 4 7 个氨基酸9 8 同源性。本文通过大量不同组织和细胞 株的c d n a 为模板进行r t - p c r 结合p c r 产物测序，证实了h c a p l 基因是不同于 g e m i n 4 基因的一个非常保守的看家基因，在发育的不同阶段、不同的细胞和组织中 都表达；而g e m i n 4 基因只在胚胎性组织中和恶性肿瘤细胞中表达。h c a p i 基因的功 能不同于g e m i n 4 基因的功能。 h c a p l 基因在d n a 水平存在单核苷酸多态性( s n p ) 。统计学分析证明5 个s n p 位点有连锁相关性。因此将5 个位点的少数等位基因型称为h c a p i m ，多数等位基 因型称为h c a p i n 。最初从c d n a 文库中筛选到的克隆为h c a p i m 型。本论文克隆 了h c a p l n 型c d n a 以多个人外周血d n a 为模板分别用p c r 方法扩增h c a p ic 端l ，6 k b 序列，将p c r 产物纯化后与p t - a d v 载体用t a 克隆法连接，阳性克隆测序 后与h c a p l m c d n a b l a s t 比较，筛选到编号为8 0 1 0 的克隆为目的克隆。将a p a li 与c l ai 酶切p t - a d v 8 0 1 0 克隆释放的1 6 k b 片段、e c o r i 与a p a l i 酶切 p b k c m v h c a p l m 型d n a 释放的2 3 k b 片段和e c o r i 与c l a i 酶切过的p b k c m v 载体片段三者进行连接，得到h c a p i n 克隆。h c a p l n 型和m 型序列比较有8 个碱 基差异包括6 个s n p 位点，其中3 个s n p 引起氨基酸的改变，即3 0 4 5 位的g 变成 c ，相应的氨基酸g l y 变成a l a ；3 0 8 7 位的a 变成t ，相应的氨基酸g l u 变成v a l ；4 4 0 6 位的t 变成c ，相应的氨基酸c y s 变成a r g 。 将h c a p l n 和h c a p i md n a 亚克隆到真核生物表达载体p c m v - s c r i p t ，用脂质 体介导的方法转染肝癌细胞株h e p 3 b 和h e p g 2 细胞，h c a p i n 和h c a p i m 抑制 h e p 3 b 和h e p g 2 细胞克隆形成数目，并且h c a p i m 抑制效果没有h c a p i n 抑制明 显。m t s 法测定转染h c a p l n 或h c a p i m 后h e p 3 b 细胞生长速度，结果表明 h c a p i m 平均抑制率为3 1 8 ，h c a p i n 平均抑制率为4 4 4 6 ，h c a p l m 比h 翻p ， 抑制率低1 2 6 。为了研究h c a p i n 型和肘型的对肝癌细胞生长抑制的分子机制， i i c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 甚【捌功能研究 中艾摘嘤 我们利用t c t o n 基因表达系统，构建了两株h c a p l n 和h c a p l m 表达受d o x 诱导 调控的细胞株：将p t e t o n 质粒转染h e p 3 b 细胞，单克隆化，通过瞬时转染p t r e l u c 筛选得到一株高表达、低背景的h e p 3 b t e t o n 细胞株：构建重组表达载体 d t r e 2 一h c a p i n 和p t r e 2 h c a p l m ，将p t r e 2 一h c a p l n 和p t r e 2 一h c a p ，m 分别转 染h e p 3 b t e t o n 细胞，单克隆化，通过w e s t e mb l o t 筛选得到h c a p l n 和h c a p i m 表达受d o x 诱导调控的细胞株：h e p 3 b t e t o i l h c a p l n 和h e p 3 b t e t o n h c a p i m 。 将细胞株总r n a 反转录后的c d n a 与a t l a sh u m a nc d n a a r r a y 杂交，得到h c a p l n 和h c a p l m 诱导表达前后的细胞基因表达谱。a t l a s 杂交分析结果：h c a p l n 和m 共同上调某些抑癌基因的活性( 如p 1 9 一i n k 4 d ) 和下调转录因子( 如h t t 4 ) 的活性； 两者不同点：h c a p l m 还上调参与细胞增殖、肿瘤细胞的侵润、迁移和造血祖细胞 的生长、分化、存活等生物学过程的基因的表达( 如癌基因e r b b 2 受体) ，主要下调 起凋亡作用基因及d n a 切割修复基因蛋白的表达( 如e r c c 5 基因) ；h c a p l n 上调 参与抑制细胞恶性转化、细胞黏附、细胞吞噬等生物学过程基因的表达( 如依赖细胞 周期蛋白激酶抑制剂1 ) ，h c a p i n 明显下调抗凋亡基因的表达等。 以上是从d n a 水平上对h c a p i 基因功能进行的研究，为了展开h c a p l 蛋白 水平功能的研究，首先构建了重组原核表达质粒，原核表达和纯化了h c a p i 蛋白。用 纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，制备了效价为l ：1 0 0 0 0 0 的抗h c a p l 抗血清，并用 w e s t e r nb l o t 分析了抗血清的特异性( 上海生物工程中心完成) 。细胞免疫荧光实验 显示h c a p l 定位于胞浆和核仁。多组织膜片n o r t h e r nb l o t 结果表明h c a p l 在检测 的8 种组织中都表达，在骨骼肌、肝脏和胎盘中表达最高，胰脏和肾脏中表达量相近， 而在，i i , 、脑和肺中表达最少。肝癌组织和癌旁肝组织的n o r t h e r nb l o t 结果表明在转 录水平的调控上，h c a p l 在肝癌组织和癌旁肝组织中没有差异，都只有个转录本。 免疫组化没有检测到h c a p l 在正常肝组织、肝癌组织和癌旁肝组织中的表达差异。 w e s t e r nb l o t 结果显示h c a p i 基因在正常肝组织中主要表达p 5 7 蛋白，在肝癌组织 中p 5 7 蛋白高比例缺失( 7 7 7 7 ) 并且h c a p l 的表达存在地区差异。p 5 7 蛋白可能 是h c a p i 的活性形式，在各种正常组织细胞里调节着细胞生长与凋亡平衡，抑制细胞 的过度增殖，肝癌组织里p 5 7 蛋白的缺失，使细胞生长与凋亡失去了平衡，细胞过度 增殖。为了纯化天然p 5 7 蛋白，进行了以下工作：盐沉淀和离子交换层析法纯化抗 i t c a p l 抗血清，得到了抗h c a p i 多抗的i g g ，构建了抗h c a p i 抗体- s e p h a r o s e 4 b 亲和 层析柱。用反复冻溶法纯化了4 7 5k d a 6 2k d a 范围内的肝组织蛋白，经抗t t c a p i 抗体一s e p h a r o s e 4 b 亲和层析柱吸附后，用0 2 mg l y h c i 洗脱，得到纯化的p 5 7 蛋白， 可供n 一端测序，为今后的研究工作打下基础。、 关键词：h c a p l 基因克隆h c a p i nh c a p m 诱导表达w e s t e r nb l o tt e t o n 系统差异基因表达谱表达纯化p 5 7n o r t h e mb l o t h c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 坫凶功能研究 诞文摘璺 a b s t r a c t h c a p l ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) w a si d e n t i f i e db ys c r e e n i n gan o r m a lh u m a nl i v e r c d n al i b r a r yw i t hp a c 5 7 9d n a a ne x t e n s i v es t u d yw a sb e e nd o n et od e f i n et h ef u n c t i o n o t h c a p l a l t h o u g hd a t a b a s e s e a r c h e sh a v er e v e a l e d9 9 h o m o l o g yb e t w e e nh c a p ia n d g e m i n 4 ，r t - p c rr e s u l t ss h o wt h a th c a p l a n d g e m i n 4a r en o tt h es a m eg e n e h c a p ii sa c o n s e r v a t i v eh o u s e - k e e p i n gg e n ee x p r e s s i n gi nv a r i o u st i s s u e sa n dc e l ll i n e sa ta n ys t a g eo f d e v e p l o p m e n t h o w e v e r , g e m i n 4e x p r e s s e so n l yi ne m b r y o n i ct i s s u e sd u r i n ge m b r y o n i c d e v e l o p m e n to ri nt u m o rc e l l s w eb e l i e v et h a tt h ef u n c t i o no fh c a p li sd i f f e r e n tf r o m t h a to f g e m i n 4 h c 3 p 1h a sat o t a lo f1 5 s n p s l i n k a g ea n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h e r ei s as t r o n g l i n k a g ea m o n g5s n p ss i t e s t h eg e n et y p ew h i c hi n c l u d e sm i n o ra l l e l e so ft h e s e5s n p s s i t e si sd e s i g n a t e da sh c a p l ma n dt h eg e n et y p ew h i c hi n c l u d e sn o m a la l l e l e so ft h e s e5 s n p ss i t e si sd e s i g n a t e da sh c a p i n t h ef o r m e rh a sb e e nc l o n e df r o ml i v e re d n al i b r a r y a n dt h el a t e rw a si d e n t i f i e df r o mn o r m a lh u m a n p e r i p h e r a lb l o o dc e l l sb yp c rm e t h o d c o m p a r i n gh c a p l mw i t hh c a p i n 8d i f f e r e n t i a lb a s ep a i r sa r eo b s e r v e di n c l u d i n g6 s n p ss i t e s t h r e es n p sa m o n go t h e r s ，g 3 0 4 5 c ，a 3 0 8 7 ta n dt 4 4 0 6 cr e s u l ti na m i n oa c i d c h a n g e s t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d so fp c m v - s c r i p t h c a p i na n dp c m v - s c r i p t h c a p i m w e r ec o n s t r u c t e d t h eh e p a t o c a r c i n o m ac e l ll i n eh e p 3 ba n dh e p g 2w e r et r a n s f e c t e dw i t h p c m v - s c r i p t h c a p l no rp c m v - s c r i p t h c a p l mv e c t o ru s i n gl i p o s o m et r a n s f e c t i o n r e a g e n t t h ec o l o n yf o r m a t i o ne x p e r i m e n ts h o w e dt h a tb o t hh c a p lp r o t e i nt y p e sc o u l d r e d u c et h en u m b e r so fc o l o n yf o r m a t i o na n ds u p p r e s st h eg r o w t ho fh e p 3 ba n dh e p g 2 c e l l s t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fh c a p i no nc e l l sw a ss t r o n g e rt h a nt h a to fh c a p i m m t s m e t h o dr e v e a l e dt h a t i nh e p 3 bc e l l st h ei n h i b i t o r yr a t e so fh c a p na n dh c a p ，mw e r e e s t i m a t e dt ob e4 4 4 6 a n d31 8 r e s p e c t i v e l y i no r d e rt o c o m p a r et h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fa c t i o no ft h et w og e n e t y p e si nc e l l s ，h e p 3 b t e t o n h c a p i na n d h e p 3 b t e t 。o n 。h c a p i mc e l ll i n e sw e r ec o n s t r u c t e du s i n gt e t o ng e n ee x p r e s s i o ns y s t e m t h eh e p 3 bc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hp t e t o nv e c t o ru s i n gl i p o s o m et r a n s f e c t i o nr e a g e n t ， o n eh e p 3 b t e t o nc e l ll i n e ，w h i c he x h i b i t e dh i g hl e v e l so fi n d u c t i o na n dg e n ee x p r e s s i o n ， i i c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n ”坫i 捌功能研究 英文摘鹾 w a sf i r s t l yo b t a i n e d t h eh e p 3 b t e t o nc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hp t r e 2 一h c a p i no r p t e r 2 一h c a p i mu s i n gl i p o s o m et r a n s f e c t i o nr e a g e n t i no r d e rt o o b t a i nt h ec e l l sw i t h h l g hi n d u c i b l ee x p r e s s i o no fh c a p i n o rh c a p i m ，t h et r a n s f e c t e dc e l l sw e r es c r e e n e db y w e s t e r nb l o t t i n g ，t h e nh u m a na t l a se d n ae x p r e s s i o na r r a y sw e r eu s e dt oa n a l y z ec e l l u r l a r g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e sb e f o r ea n da f t e rh c a p i n o rh c a p l m o v e r - e x p r e s s i o n ，r e s u l t s w e r ea n a l y z e dw i t hf r 一2 0 0i m a g es y s t e m t h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n ep r o f i l e s b e f o r ea n da f t e rh c a p i no rh c a p i mo v e r e x p r e s s i o nw e r ee s t a b l i s h e d t h e s ed a t a i n d i c a t e dt h a tat u m o rs u p p r e s s i n gp r o t e i n ( p l9 i n k 4 d ) a n dp r o c a s p a s e10w e r eb e e nu p r e g u l a t e db o t hi nh e p 3 b t e t o n m h c a p i na n dh e p 3 b t e t o n h c a p l mc e l ll i n e s e x c e p t f o rt h a t ，o v e r - e x p r e s s i o no fh c a p i mr e s u l t e di na nu p r e g u l a t i o no fg e n e si n v o l v e di n c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n ( e g c e r b b 2r e c e p t o r a n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r d p 2 ) a n d a d o w n - r e g u l a t i o no fg e n e si n v o l v e di nc e l l u l a ra p o p t o s i s ( c a s p a s e 9 ) o rd n ar e p a i r ( x p g ) w h i l eo v e r e x p r e s s i o no fh c a p i nr e s u l t e di na nu p r e g u l a t i o no fg e n e si n v o l v e di n c e l l u l a rs u p p r e s s o r s ( e g s n o na n dw a fi ) o rd n a r e p a i r ( x p g ) a n dad o w n r e g u l a t i o no f g e n e si n v o l v e di na n t i a p o p t o s i s ( h s p s ) 【no r d e rt oo b t a i na n t i b o d i e sa g a i n s th c a p1 t h ep r o k a r y o t i cr e c o m b i n a n te x p r e s s i n g p l a s m i d sw a sc o n s t r u c t e d ，h c a p lw a se x p r e s s e di ne c o l id e 3c e l l sa n dp u d f i e d t h e m a l en e wz e a l a n dw h i t er a b b i tw a si m m u n i z e dw i t hp u r i f i e dh c a p1a n dt h er a b b i t a n t i h c a p la n t i s e r u mw i t ht i t r eo f1 ：1 0 0 ，0 0 0w a sp r e p a r e d t h es p e c i f i c i t yo f a n t i s e r u m w a sa n a l y z e db yu s i n gw e s t e r nb l o tm e t h o d i nt h ec e l ll i n e st h ee x p r e s s i o no fh c a p1w a s a l s oa n a l y z e db yu s i n gw e s t e r nb l o tm e t h o d h c a p1w a sl o c a l i z e di n c y t o p l a s ma n d n u c l e o l iu s i n gf l u o r o i m m u n o c y t o c h e m i s t r yt e c h n i q u e m t nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a th c a p lw a se x p r e s s e di nm a n yt i s s u e sa n ds h o w e da h i g h e re x p r e s s i o nl e v e l so fi ns k e l e t a lm u s c l e ，l i v e ra n dp l a c e n t at i s s u e s ，m o d e r a t ei n k i d n e ya n dp a n c r e a st i s s u e sa n dl o w e ri nh e a r t ，b r a i na n dl u n gt i s s u e s n o r t h e r nb l o t a n a l y s i ss h o w e dt h a ti nh c c t i s s u e sa n da d j a c e n tn o n c a n c e r o u sl i v e rt i s s u e sh c a p lw a s p r e s e n t e do n l yo n et r a n s c r i p tw i t hn od i f f e r e n c e i na d d i t i o n ，i m m u n o c h e m i s t r ym e t h o dd i d n o ts h o wa n yd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no f h c a p lb e t w e e nh c ca n di t sa d j a c e n tl i v e rt i s s u e s h o w e v e rw e s t e r nb l o ta n a l y s i sd e t e c t e dt h ep r e s e n c eo fp 5 7p r o t e i ni nn o r m a ll i v e rt i s s u e s a n da d j a c e n tn o n c a n c e r o u sl i v e rt i s s u e s ，a n di tw a sd e f i c i e n c yi nm o s th c ct i s s u e s t h e e x p r e s s i o no fh c a p ii ns a m p l e sf r o mq i d o n gi sd i f f e r e n tf r o mt h a tg u a n g x i t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a tp 5 7m a yb ea na c t i v ep e p t i d eo fh c a p1a n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n t h en o r m a lb a l a n c eb e t w e e nt h ep r o l i f e r a t i o na n dd e a t ho fc e l l s b yi n h i b i t i n g e x c e s s c e l l u l a rg r o w t h t h el o s so fp 5 7b r e a k sc e l l u l a rh o m e o s t a s i sr e s u l t i n gi nu n c o n t r o l l e dc e l l i f g i p i ( h c c a s s c , e i a t e dp r o t e i nl 、蟮因功能研究 英艾摘垫 p r o l i f e r a t i o n i no r d e rt oc l a r i f yi t sb i o c h e m i c a la n db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，p 5 7p r o t e i n w a s p u r i f i e d b yu s i n g s a l t p r e c i p i t a t i o n a n di o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yt h e a n t i h c a p1a n t i b o d i e sw e r ep r e p a r e da n da n t i h c a p1a n t i b o d i e s s e p h a r o s e 4 ba f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yc o l u m nw a sc o n s t r u c t e d t h ep 5 7p r o t e i nw a sg o tu s i n gi m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dp 5 7p r o t e i nh a dh i g hs p e c i f i c i t y t o a n t i h c a p1a n t i s e r u m i tc a nb eu s e dt op r o t e i ns e q u e n c i n g k e yw o r d s ：h c a p lg e n e ；a n t i h c a p la n t i b o d i e s ；e x p r e s s i o n ；h c a p i n ：h c a p l m ： t e t o ns y s t e m ；i n d u c i b l ee x p r e s s i o n ；d i f f e r e n t i a l l yg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s ； p 5 7 ；w e s t e r nb l o t ；n o r t h e r nb l o t t t c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 肚【q 功能研究 前高 刖吾 我国是一个肝癌高发国家，与其它肿瘤一样，肝癌的发生发展是一个多步骤的 过程，涉及到多个相关基因结构和表达调控的改变，尤其是癌基因与抑癌基因的变化。 1 7 号染色体短臂与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系。著名的p 5 3 基因即定 位于1 7 p 1 3 1 区域。近来越来越多的文献报道1 7 p 1 3 3 区域可能与多种肿瘤的发生有 关，如成神经管细胞瘤，星形胶质细胞瘤，原发性外胚层肿瘤，乳腺瘤，卵巢瘤，肾 细胞瘤和肝癌等【i 。j 。提示此区域可能含有一个或多个抑癌基因或癌基因。 我们实验室于上世纪九十年代仞发现肝细胞肝癌( h e p a t o c e t l u l a rc a r c i n o m a h c c ) 患者在染色体1 7 p 1 3 3 处存在高比例杂合性缺失，且上海和启东地区的肝癌患 者人群之间1 7 p 1 3 3 杂合性丢失的比例和p 5 3 基因2 4 9 号密码子的突变频率存在差异 m ”。该结果提示在1 7 p 1 3 3 区带内可能存在着一个或几个不同于p 5 3 的新的肿瘤相 关基因。后来我们实验室作了全基因组扫描，结果显示肝癌组织1 7 p 1 3 3 有5 0 以上 存在l o h j ，亦将这一杂合性缺失区缩小到最小范n ( o 5 o 6 m b ) ，这一范围在肝癌组 织中缺失频率为6 0 - 1 0 0 9 j ，其中d 1 7 s 9 2 6 位点杂合性缺失频率最高。我们试图从 1 7 p 1 3 3 高比例杂合性缺失区内寻找到肝癌相关基因，用含d 1 7 s 9 2 6 位点的人基因组 p a c 5 7 9 插入片段筛选人正常肝c d n a 文库，结合r a c e 方法克隆新基因全长。其 中h c a p l 基因( 先前又称h c 5 6 ) 即是从1 7 p 1 3 3 离比例杂合性缺失区内克隆到的新 基因之一，g e n b a n k 登录号为a f l 7 7 3 4 1 ，登录日期为1 9 9 9 年8 月6 号。初步研究 表明h c a p i 基因可能与肝癌的发生发展有关，是一个新的肝癌相关基因的候选者， 所以命名为肝癌相关蛋白【1 0 1 ( h c c a s s o c i a t e d p r o t e i n1 h c a p l ) 。 h c a p ic d n a 全长为4 7 5 2b p ，含一个3 1 4 lb p 的开放阅读框，编码一个具有1 0 4 7 个氨基酸残基的蛋白质，翻译起始位点位于第1 3 4 3 位核苷酸处，其上游同- - n 读框 内的培7 位核苷酸处出现终止密码t a a 。编码框的终止密码子位于4 4 8 4 位。4 7 0 8 4 7 1 2 处的a t a a a 是典型的p o l y ( a ) i j l 尾信号。h c a p i 的全长c d n a 序列与p a c 5 7 9 的基 因组序列( g e n b a n k 登录号为a f 2 5 8 5 4 5 ，基因组测序工作由基康公司完成) 进行对 比分析发现h c a p i 为单一外显子基因。 对h c a p i 基因推导的蛋白质所作的一级结构分析结果显示该蛋白质是一个等电 点为5 8 5 的弱酸性可溶性蛋白质，分子量为1 1 9k d a ，有十二个蛋白激酶c 磷酸化位 点，二十个酪蛋白激酶磷酸化位点，一个酪氨酸磷酸化位点，五个潜在的天门冬酰胺糖 基化位点，六个肉豆蔻酸化位点，两个酰胺化位点。另外，2 5 6 2 6 4 处的氨基酸顺序 h c a p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 旌【n 功能研兜 符合m y c 类双螺旋一环一双螺旋二聚体区的保守一级结构特征，7 0 3 7 2 4 处的氨基酸顺 序具有典型的亮氨酸拉链结构特征。h c a p i 的基因结构见图l 。 同源性分析发现，h c a p i 基因与c h a r r o u sb u l 等人用免疫共沉淀法克隆的g e m i n 4 基因核苷酸序列有9 9 n 源性。h c a p i 与g e m i n 4 是否为同一个基因? 本论文第一部 分的研究表明h c a p i 基因不同于g e m i n 4 基因。h c a p l 基因是一个未知功能的新基 因。 通过直接测序对2 4 例肝癌病人外周血与正常人外周血的s n p ( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ) 检测，发现h c a p l 基因在d n a 水平存在单核苷酸多态性( s n p ) ， 共有1 5 个s n p 位点，3 个s n p 位点位于3 u t r ，1 2 个s n p 位点位于编码区内( c s n p ) ， 其中9 个s n p 引起氨基酸的变化见图l 和表l 。另外检测了启东地区2 2 例肝细胞性 肝癌患者的外周血和1 4 0 例正常人外周血，发现h c a p i 基因1 5 个s n p 位点中，有 6 个s n p 出现频率较高，即g 3 0 4 5 c 、a 3 0 8 7 t 、g 3 3 6 0 a 、t 4 4 0 6 c 、c 4 4 3 5 t 、g 4 6 0 4 a 。 统计学分析证明g 3 0 4 5 c 位点在正常人外周血与病人外周血之间有显著差异，g 3 0 4 5 c 和t 4 4 0 6 c 在肝癌患者外周血与患者h c c 样本之间有显著差异，并且除g 3 3 6 0 a 位 点外5 个位点有连锁相关性。相关性分析证明除g 3 3 6 0 a 位点外5 个位点与h c c 都 有显著的相关性。大量的样本s n p 检测结合统计学分析发现6 个s n p 位点中，c 3 0 4 5 、 t 3 0 8 7 、 a 3 3 6 0 、c 4 4 0 6 、t 4 4 3 5 和a 4 6 0 4 这6 个碱基在正常人群间出现的频率较 低，为少数人的等位基因型( m i n o ra l l e l e s ) ，g 3 0 4 5 、a 3 0 8 7 、g 3 3 6 0 、t 4 4 0 6 、c 4 4 3 5 和g 4 6 0 4 这6 个碱基在正常人群间出现的频率较高，为多数人的等位基因型( n o r m a l a l l e l e s ) 统计学分析证明这些m i n o ra l l e l e s 在肝癌病人的外周血内出现的频率高于 正常人外周血内出现的频率，同例患者的h c c 样本与外周血相比，在h c c 样本内 这些位点的杂合性频率降低，并且杂合性缺失的比例高达5 8 。从正常人肝c d n a 文库中克隆的h c a p l 基因含有以上6 个s n p 位点基因型分别是c 3 0 4 5 ，t 3 0 8 7 ， g 3 3 6 0 ，c 4 4 0 6 ，t 4 4 3 5 ，a 4 6 0 4 ，除g 3 3 6 0 位点外，其它5 个s n p 位点基因型是m i n o r a l l e l e s ，因此我们称之为h c a p im 型( m i n o ra l l e l e sa ta l ls i xs n ps i t e s ) 。多数人所具 有的基因型6 个s n p 位点分别是g 3 0 4 5 ，a 3 0 8 7 ，g 3 3 6 0 ，t 4 4 0 6 ，c 4 4 3 5 ，g 4 6 0 4 ，因此 我们将其称之为h c a p in 型( n o r m a la l l e l e sa t a l ls i xs n ps i t e s ) 。圩翻p jm 型和 h c a p ln 型功能有何不同? 本论文第二部分和第三部分研究了h c a p i 两种不同基 因型的功能。 本论文第四部分从r n a 水平和蛋白水平上利用不同的方法研究了h c a p i 在肝 癌组织和癌旁肝组织的表达差异。 l i e , i p i ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n 坫i ) qj j j 能研究 奇 f i g u r e1 g e n es t r u c t u r eo fh c a p l n o1 - n o1 5 ：s n ps i t e s ；h l h ：h e l i x l o o p h e l i x ；l z ：l e u c i n e z i p p e r t a b l e1 s u m m a r yo fs n ps i t e si nh c a p l 编号 s n p 位点编码氨基酸位点 核苷酸变化氨基酸变化 c 2 0 0 6 t a 2 0 8 2 g g 2 3 8 6 a g 2 6 5 7 c a 2 8 1 3 g 匝固 圆 g 3 3 6 0 a g 3 8 4 1 a a 4 0 9 4 g f 4 4 0 6 c e ! 塑卫 c 4 5 5 2 t c 4 5 6 6 g 匝圈 框内为连锁相关性的5 个s n p 位点 2 2 2 2 4 7 3 4 8 4 3 9 4 9 0 5 6 8 5 8 2 6 7 3 8 3 3 9 2 6 1 0 2 2 1 0 3 1 3 u t r 3 u t r 3 u t r c _ t a g g a g jc a g g + c a t g _ a g a a g t c c _ t c t c g g a p r o g l u a l a s e r a r g g i u g l n i l e v a l g l v a l a a r g + g l n g l u a s l l a s o c y s + a r g ， 2 3 4 5 6 7 8 9 m ” 坦 侣 垤 i i c a p i h c c a s s o o l a l e dp r o t e i n 磋功能研究 第一部分材料j 方 上 第一部分h c a p i - n n - 与胁4 基因比较 h c a p l ( h c c a s s o c i a t e dp r o t e i n1 ) 基因是我们实验室通过用p a c 5 7 9 插入片段 为探针筛选人正常肝e d n a 文库和r a c e 方法克隆到的一个新基因【”i 。该基因位于 染色体1 7 p 1 3 3 杂合性缺失区内，全长e d n a 为4 7 5 2b p ，编码1 0 4 7 个氨基酸，g e n b a n k 登录号为a f l 7 7 3 4 1 。 g e m i n 4 基因是德国h o w a r dh u g h e s 医学研究所欧洲分子生物学实验室c h a r r o u s b 】等人克隆的。他们在用抗s m n ( s u r v i v a lo f m o t o rn e u r o n s ) 抗体免疫沉淀h e l a 细胞 裂解物时发现一种新的蛋白与s m n 结合，通过测序得到这个蛋白的一段肽序列，从 e s t 数据库中找到匹配的e s t 序列，用此e s t 序列作探针筛选h u m a nl e u k e m i a 5 - s t r e t c hp l u sc d n a 文库，得到2 0 个首尾序列重复的e d n a 克隆，最后拼接得 到一个具有完整开放阅读框( o r f ) 的序列即g e m i n 4 g e n b a n k 登录号为a f l 7 3 8 5 6 全长c d n a 为3 4 7 2b p ，编码1 0 5 8 个氨基酸。 h c a p l 与g e m i n 4 基因3 4 0 9 个核苷酸9 9 n 源性，阅读框架一致，1 0 4 7 个氨基