内容简介：: 生三程食品，LI斜妓，33，NO09，2012牛旰萤藏你发酵件昀优化郭永月，陶明煊，周斌，程光宇，金邦荃1南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097；2南京师范大学生命科学学院，江苏南京2L0046摘要讨论了黑牛肝菌液体的发酵培养基最佳组成及培养条件。采用响应曲面法分析了葡萄糖、蛋白胨、装液量三个关键影响因素对菌丝体生物量的影响、结果表明黑牛肝菌发酵的最佳培养基为葡萄糖375G、蛋白胨85GL、KH2P042GL、MGSO7H20IG1、VB001GL、CACOJ2G1；培养务件为装液96ML，培养温度28，转速】60FFMIN，初始PH55。此时可达到最大菌丝体生物量254801GL关键词黑牛肝茵，响应曲面法，液体发酵，菌丝体生物量OPTIMIZATIONOFTHEGROWTHCONDITIONSINSUBMERGEDFERMENTATIONOFBOLETUSAEREUSGUOYONGYUE，TAOMINGXUAN。ZHOUBIN，CHENGGUANGYU,JINBANGQUAN1GINLINGCOLLEGE，NANJINGNORMALUNIVERSITY，NANJING210097，CHINA2SCHOOLOFLIFESCIENCE，NANJINGNORMALUNIVERSITY，NANJING210046，CHINAABSTRACTTHEOPTIMALCULTUREMEDIUMANDFERMENTATIONCONDITIONSOF日OLETUSAEREUINSUBMERGEDFERMENTATIONWERESTUDIEDRESPONSESURFACEMETHODOLOGYWASUSEDTOANALYZETHEEFFECTSOFTHETHREECRITICAIFACTORSONMYCELIABIOMASSTHETHREECRITICALFACTORSWEREGLUCOSEPEPTONEANDBROTHFERMENTATIONCONTENTTHERESULTSSHOWEDTHATTHEOPTIMALCOMPOSITIONSWEREASFOLLOWSGLUCOSE375GL，PEPTONE85GL，KH2PO42GL，MGSO47H2O1GL，VB1O01GL，CACO32GLTHEFERMENTATIONCONDITIONSWEREBROTHCONTENT96ML，TEMPERATURE28ROTATINGSPEED160RMINANDTHEINITIALPH55UNDERTHEOPTIMALCONDITIONS，THEMAXIMAIMYCELIABIOMASSWAS254801GLKEYWORDSBOLETUSAEROUS；RESPONSESURFACEMETHODOLOGY；SUBMERGEDFERMENTATION；MYCELIABIOMASS中图分类号TS2013文献标识码A文章编号L0020306201209018304黑牛肝菌BOLETUSOERCUS学名枣铜色牛肝菌，属层前纠，伞菌H，牛月十科，卜旰菌属II。黑牛肝菌生长于海拔9002200M2_口J的松栎混交林或砍伐不久的林缘地带，生长期为每年JTJ卜旬至十月中旬，在我国四川I、南、贵州等地分布广泛，在欧洲、非洲等地也有分布，是一种世界性珍稀食，FJ菌II。其味道鲜荚、营养价值较高、含有丰富的矿质元素及多种人体必需氨基酸IL。该菌具有清热解烦、养血和中、追风散寒、舒筋和血等功效L7I，可治疗妇女白带症及不孕症I。据报道，黑牛肝菌水提物具有抗痛抗病毒作用19121。然而，黑牛肝菌了实体的栽培受钊气候、季节、原材料等限制，且实体栽培投资大、技术要求高、生，周期、生产效率低，导致人工戕培非常收稿日期2011一O8一】8通讯联系人作者简介郭永月1988一，女，硕士研究生，研究方向生物活性物质与保健功能因子基金项目江苏省高校自然科学基础研究项目1OKJD550003；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目CXLXIL_0895；教学创新团队建设18L220001517优秀课程建设18L2000006209、困难L。日自黑牛肝菌人I栽培的子实体产量已经不能满足国内外市场的需求，而采用液体发酵技术生产蒲幺幺体及代谢产物代替了实体在食品和医药方面的应已成为一个新的发展方向III。液体培养发酵比固体栽培牛产实体简便、快速、易操作17181。食川菌液体培养发酵具有生产周期短、菌龄致、菌种成本低等优点，II前关于牛月十菌菌丝体液体培养的研究尚未报道。本实验采川响应曲面法RMS埘黑，卜肝蔺液体发酵培养基和培养条件做了初步探究，并优化了黑F朋菌液体发酵条件。1材料与方法11材料与设备黑，IF芮于四川省绵市食用菌研究所。YXQLSS1I全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅_J海1尊迅实LK限公司医疗设备，；DHG一9140电热温鼓风F燥箱卜海精宏实验没备有限公司；SWCJ一2F舣人双面净化T作台苏州净化设备有限公；HD一930组合式恒温振荡器太仓市实验设备厂一。食昌，II斜技SCIENCEANDTECHNOLOGROFFOODINDUSTRY12实验方法121培养基菌种活化培养基PDA固体培养基；种子液培养基葡萄糖20GL、酵母膏5GL、KH2PO2GL、MGSO7H01GL、PH自然4820】；发酵培养基葡萄糖30GL、酵母膏7L、KH2PO42GL、MGS047H20LGL、VB1001GL、CACO32GL，PH自然48。122培养方法1221菌株的活化将在4CC保存的黑牛肝菌菌株转接至新鲜PDA培养基上，在28L3D，待用。1222种子液制备用接种针挑取活化后的菌丝体适量接种至装有10MLQ子液培养基的试管中，培养温度2802，摇床转速140RMIN，培养4D即得发酵用种子液。1223液体发酵培养25ORAL锥形瓶中装入60ML发酵培养基，在121CC卜高压灭蔺20MIN后，按装液量的3接种种子液，培养温度28，摇床转速140RMIN，培养8D。每个处理过程重复7次。1224菌丝体生物量测定方法取待测发酵液过滤，用水冲洗至洗液不再带有发酵液颜色为止。在65恒温干燥箱中烘干至恒重，在干燥器中冷却到常温，称重。实验数据采用DPS软件处理21。123液态发酵培养基组成的单因素实验1231最适碳源的筛选本实验选取蔗糖、麦芽糖、乳糖为供试碳源。分别将供试碳源以30GL替代121中发酵培养基中的葡萄糖，按1223法进行发酵，测定菌丝体生物量，确定最适碳源。1232最适氮源的筛选本实验选择蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和硝酸钾作为发酵供试氮源，分别以7GL的上述试剂替代发酵培养基中的酵母膏，发酵后测定菌丝体生物量，确定最适氮源。124液体培养条件的单因素实验1241最适培养温度的筛选按1223分别在24、26、28、30、32OC进行发酵培养，发酵结束后取菌丝体生物量平均值为指标，确定最适培养温度。1242最适初始PH的筛选实验分别设定发酵培养基的初始PH为35、45、55、65、75及自然PH48，按1223发酵结束后测定菌丝体生物量，确定发酵最适初始PH。1243最适转速的筛选分别设定摇床转速为100、120、140、160RRAIN，按1223发酵8D后，称量菌丝体生物量来确定最适转速。1244最适装液量的筛选在250ML锥形瓶中发酵，分别设定装液量为45、60、75、90ML，按1223发酵结束后称量菌丝体生物量，确定最适装液量。125响应曲面法优化液态发酵条件在单因素实验的基础上，应用DESIGNEXPERT700软件，根据BOX一表1响应面分析因子及水平TABLE1FACTORSANDLEVELSOFTHERESPONSESURFAEE生程BEHNKEN中心组合实验设计原理，以菌丝体生物量YD为响应值，设计三因素三水平响应面分析实验，对黑牛肝菌液体发酵条件进行优化，因子编码及水平见表1。2结果与讨论21液态发酵培养基组成的单因素实验结果211最适碳源的确定由表2可以看出，当葡萄糖作为碳源时，可获得最大菌丝体生物量为240531GL。且菌丝球体大小均匀，密度大，发酵液呈均匀的淡黄色。葡萄糖做碳源时，相比于麦芽糖、蔗糖、乳糖，菌丝体生物量达到1极显著水平。所以，选择葡萄糖为黑牛肝菌的最适碳源。表2不同碳源对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响TABLE2EFIEETOFDIFFERENTCARBONSOURCESONMYEELIABIOMASSOFBOLETUSAEFEUINSUBMERGEDFERMENTATION注不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著；表3表7同。212最适氮源的确定由表3可以看出，对不同氮源，黑牛肝菌的利用情况差异显著。对蛋白胨和酵母膏利用情况较好，菌丝体生物量分别可达253817GL和24053LGL；蛋白胨与其他四种氮源相比，菌丝体生物量达到了极显著差异。而无机氮源不大适合黑牛肝菌菌丝体的生长。采用硝酸钾做氮源的培养基中，菌丝球体大小参差不齐，发酵液颜色呈深黄色。因此，选择蛋白胨为黑牛肝菌的最适氮源。表3不同氮源对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响TABLE3EFFECTOFDIFFERENTNITROGENSOURCESONMYCELIABIOMASSOFBOLETUSORELSINSUBMERGEDFERMENTATION22液体培养条件的单因素实验结果221最适培养温度的确定由表4可知，在28OC时，菌丝体生物量达到最大值24053LGL，而之后随着温度的增加，菌丝体生物量降低，可能是温度影响黑牛肝菌内酶活力的原因。但在5和1显著水平表4不同温度对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响TABLE4EFFECTOFDIFFERENTTEMPERATURESONMYCELIABIOMASSOFBOLETUSAEREUINSUBMERGEDFERMENTATION生物三连食品，II斜枝，不同温度对黑牛肝菌生长的影响几乎无差异。因此，确定黑牛肝菌最适的培养温度为28OC。222最适初始PH的确定由表5可知，不同初始PH对菌丝体生长无显著影响。当PH55时，生物量达到最大值253594GL。菌丝体在偏酸性Y4,境中长势稍好，而在偏碱性环境中菌丝体生物量略有减少。选择55为黑牛肝茼的最适初始PH。表5不同初始PH对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响TABLE5EFFECTOFDIFFERENTINITIALPHONMYCELIABIOMASSOFBOLETUSOEREUINSUBMERGEDFERMENTATION223最适转速的确定由表6可以看出，在160RRAIN时，菌丝体生物量达到最大值253592GL。按菌丝体生物量排序为160RMINL40RMIN120RMINLOORMIN，随着转速的增加，菌丝体生物量也增多。这与培养基中溶解氧程度有关，转速越高，溶解氧越多，比较适合菌丝体生长。但从表6中町以看，在5显著水平上，转速为100RRAIN时，菌幺幺体生物量与其他I个转速有显著差异，这是由于转速小岛，溶解氧稍低的缘故。但在1显著水平，转速的高低对菌丝体生物量的影响无极显著差。儿转速小的培养基叶L菌丝球生长都较均匀，发酵液颜色几乎无差异，均为淡黄色。综合考虑，选择160RRAIN为最适转速。表6不同转速对黑牛肝蔺液体发酵丝体生物量的影响TABLE6EFFECTOFDIFFERENTROTATINGSPEEDONMYCELIABIOMASSOFBOLETUSAEREUINSUBMERGEDFERMENTATION224最适装液量的确定由表7可明显看出，在5显著水平上，不同装液量对菌丝体生物量影响显著；在1极显著水平上，装液量为75ML与45ML和90ML差异极为显著。在装液量为45ML时，菌丝体生物量仅有224584GL，菌丝球少且不饱满，大小差异很大，这是由于培养基营养物质缺乏引起的。而当装液量为90ML时，菌丝体生物量略有减少，这与氧气的溶解量有关。综，确定75ML为最适装液量。表7不同装液量对黑牛肝菌液体发酵菌丝体生物量的影响TABLE7EFFECTOFDIFFERENTBROTHCONTENTONMYCELIABIOMASSOFBOLETUSCLEREUINSUBMERGEDFERMENTATION装液量ML菌丝生物量GL5显著水平1极显著水平33，NO09，201223响应曲面法优化液态发酵条件结果综合因素实验的结果，发现碳源、氮源、装液量这三个因素对黑牛肝菌菌丝体发酵影响差异显著。以葡萄糖A、蛋白胨B、装液量C这一个关键影响素为白变量，以菌丝体生物量Y为变量设立17个实验组及所得结果见表8。表8BOXBEHNKEN设计方案及响应值TABLE8BOXBEHNKENDESIGNANDCORRESPONDINGVALUE231【口归方程的建立设计按照DESIGNEXPERT软件中的BOXBEHNKENDESIGN模型对实验获得的菌丝体生物量进行回归，建立二次回归模型。回归方程为Y2597016A07B052C031AB021AC一0015BC131A069B2_040C式1对旧归方程式1进行检验，相关系数R09814，PO0001，表明回归模型显著，拟合程度好，FF实际应用意义。其中蛋白胨BP0O001为极度显著影响因素，装液量CP0O1为高度显著影响因素，葡萄糖AP0079影响较为显著。232响应面分析与优化采用响应面分析关键点值，其编码坐标为0743，0725，0828，对应的实际值为3743，845，9569，此时可以得到最大菌丝体生物量为257726GL。图1图3为通过DESIGNEXPERT得到的响应面分析图，每个响应面分别代表着2个独IL变量之问的交互作用，此时第三个变量保持在最佳水平。由图1图3可以看出葡萄糖、蛋白胨、装液VL随O0I图1葡萄糖与蛋白胨交互作用影响菌丝体生物量FIG1INTERACTIVEEFFECTOFGLUCOSEANDPEPTONEONMYCELIABIOMASSFSDENCEANDTECOLOGROFFOODINDUSTRYO0GL葡萄糖与装液量交互作用影响菌丝体生物量INTERACTIVEEFFECTOFGLUCOSEANDBROTHCONTENTONMYCELIABIOMASS罔3蛋白胨与装液量交互作用影响菌丝体生物量FIG3INTERACTIVEEFFECTOFPEPTONEANDBROTHCONTENTONMYCELIABIOMASS量与菌丝体生物量存在相关性。蛋白胨对菌丝体生物量影向十分显著，曲线非常陡峭。装液量影,IAJR2_，最后是葡萄糖，响应面分析显著性与方程分析结果一致。233优化与验证为操作方便，将上述最佳条件优化为葡萄糖375GL，蛋白胨85GL，装液量为96MI，按此条件重复实验7次，所得菌丝体生物量均值为254801GL，误差为113，实验结果与模拟方有较高的一致性。_大J此该方程充分验证了所建模型的_LF_确性，说明响应面法适用于黑牛肝茼液体发酵产菌丝体的回归分析和参数优化。3结论本实验在单因素实验的基础上，利用实验设软DESIGNEXPERT，采用BOXBEHNKENDESIGN建了葡萄糖、蛋白胨与装液量和茼丝体生物量之间的二次多项数学模型式1，对式1回归方程进行检验，市H关系数R09814，P00001，表明回归模型显著，拟合程度好，有实际应用意义。利用模型的响应面对影响黑牛肝菌菌丝体生物量的关键因子及其相瓦作用进行探讨，优化出黑牛肝荫液体发酵培养的最件条件。最佳培养基组成为葡萄糖375L、蛋白胨85GI、KH2PO42GL、MGSO47H2O1GL、VBL001GL、CACO32GL；最佳培养条件为装液一L，培养温度282，转速160RMIN，初始PH为55。菌丝体牛物量的预测值为257726GL，验证值为254801GL，误差为113。因此此模型是合理可靠的，可用于实际预测。参考文献生王程1李泰辉，宋斌中国食用牛肝茵的种类及其分布IJJ食用菌学报2002922230，F21OWENL，MCCONNELL，ERNSTEBOTHBOLETUSDUPAINIIINNORTHAMERICAJFIELDMYCOLOGY，2002，33103104F31邓百万，陈文强美味牛肝菌营养茵丝体与野生子实体品质分析JI中国食用菌，2004，2354446【4周庆珍，苏维词贵州野生多汁乳菇营养成分分析【JI营养学报，2003，2521301325阮海星，张卫国，付家华，等香菇多糖及营养成分分析微量元素与健康研究，2005，2233536【6DENTINGERABTM，AMMIRATIJF，BOTHEE，ETA1MOLECULARPBYLOGENETICSOFPORCINIMUSHLOONLSBOLETTASSECTIONBOLETUSLJIMOLECULARPHYLOGENETICSANDEVOLUTION，2010，573127612927】殷建忠，周玲仙云南野生菌维生素B、BZ舍量分析营养学报，2003，252L63一L66【8】吴学谦，李海渡，吴庆其，等黄靛牛肝菌子实体营养成分分析评价【J1食用菌学报，2005，1221923【9李志洲美味牛肝菌多糖的抗氧化性JI食品与发酵工业，2007，334495110】王一心，杨桂芝，狄勇，等黑牛肝菌对高脂血症大鼠血脂及抗氧化能力的影响LJ1中华预防医学杂志，2004，3856811王茂盛，连宾美味牛肝菌研究J1贵州林业科技，2003，3133437F121李平，李娟，汤婕美味牛肝茵及其深层发酵液中风味物质的研究IJ】食品与发酵工业，2007，3310L

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