（化学专业论文）酰化酶催化cn键michael加成研究.pdf

摘要 酶促合成方法已越来越广泛地应用于有机合成研究，酶在有机介质中表现出的催 化多功能性为有机合成提供了更多途径。本文主要研究了有机相中酰化酶催化的 m i c h a e l 加成反应，酰化酶催化c - n 键m i c h a e l 加成反应合成氮杂环衍生物的方法以 及有机介质中酶催化酰化m i c h a e l 加成串联反应。 论文研究了有机介质中酰化酶催化的m i c h a e l 加成反应，主要包括唑类、胺类等 氮化合物以及硫醇类化合物与丙烯酸酯的反应；考察了3 种酰化酶的m i c h a e l 催化活 性，结果表明具有锌离子活性中心的d 氨基酸酰化酶和“a m a n o ”酰化酶具有较高 的m i c h a e l 加成催化活性。无酶、失活酶、牛血清蛋白的实验表明m i c h a e l 加成是酰 化酶活性中心的催化行为。论文对锌离子活性中心酰化酶的m i c h a e l 加成催化机理开 展了研究，通过活性位点抑制酶实验进行了验证。 论文研究了酰化酶催化的c - n 键m i c h a e l 加成反应，研究了供体结构和受体结构 以及实验条件对反应的影响。脂肪胺类与氮杂环类化合物能很好地被酰化酶催化进行 c - n 键m i c h a e l 加成；在不同结构氮杂环供体中，吸电子能力与具有较小的空间位阻 的取代基有利于反应的进行。考察了丙烯酸酯链长度，不饱和键上取代基位阻，腈基、 乙酰基、羧基、酰胺基、酯基等与不饱和键共轭官能团变化等因素对反应的影响；结 果表明较短的酯链、不饱和键上较小位阻的取代基以及吸电子共轭官能团将有利于反 应进行。考察了溶剂、反应温度、酶加入量、底物浓度等因素对酰化酶催化m i c h a e l 加成反应的影响：结果表明禾硝基咪唑与丙烯酸甲酯在d m s o 中，当d 氨基酸酰化 酶的浓度为1 5 m gm 1 1 时， 5 0o c 条件下3 小时产率可达9 0 。 论文研究了有机介质中酶催化酰化m i c h a e l 加成串联反应，主要研究酰化酶催化 酰化m i c h a e l 加成串联反应及蛋白酶、酰化酶双酶催化酰化m i c h a e l 加成串联反应， 并通过酰化反应与m i c h a e l 加成反应合成嘧啶单糖酯衍生物。酰化反应主要研究蛋白 酶、酰化酶催化单糖与丙烯酰氧基丙烯酸乙烯酯、丙烯酸乙烯酯以及各类嘧啶取代的 丙酸乙烯酯的反应；m i c h a e l 加成主要研究酰化酶催化丙烯酰氧基丙烯酸乙烯酯、丙 烯酸乙烯酯以及不饱和单糖酯与尿嘧啶衍生物进行的c - n 键m i c h a e l 加成；双酶催化 酰化m i c h a e l 加成串联反应主要考察了酰化酶催化m i c h a e l 加成一蛋白酶催化酰化串联 饿塑型竺竺竺兰一 n 甾矿 与蛋白酶催化酰化酰化酶催化m i c h a e l 加成串联。通过分步与串联反应，共合成2 种不饱和单糖酯、3 种尿嘧啶类取代丙酸乙烯酯、1 2 种尿嘧啶单糖酯衍生物。 论文总共合成了4 4 种m i c h a e l 加成产物，其中1 2 种尿嘧啶单糖酯衍生物为新化 合物，产物经1 h - n m r 、”c - n m r 、f t i r 、e s i m s 、h r m s 等手段表征分析和验证。 关键词：催化多功能性，酰化酶，m i c h a e l 加成，氮杂环化合物，串联反应。 a b s t r a c t e n z y m e sh a db e e nm o r ea n dm o r ew i d e l yu s e di no r g a n i cc h e m i s t r y e n z y m a t i c s y n t h e s i si no r g a n i cm e d i ah a sb r o u g h t a b o u ta ne x p o n e n t i a li n c r e a s ei ni n t e r e s ti nt h ef i e l d o fo r g a n i cs y n t h e s i sa n dp r o v i d e sal a r g en u m b e ro fa l t e m a t v em e t h o d sf o ro r g a n i c s y n t h i s e s t h i st h e s i sf o c u s e so na c y l a s e s c a t a l y z e dm i c h a e la d d i t i o n o fn - h e t e r o c y c l e si n o r g a n i cm e d i a a n de n z y m e - c a t a l y z e dc a s c a d ea c y l a t i o n m i c h a e la d d i t i o n i nt h i st h e s i s ，w er e s e a r c h e da c y l a s e s c a t a l y z e dm i c h a e la d d i t i o no fc - n ，c - sa n d c - ob o n d u n d e rt h ec a t a l y s i so ft h r e ep r o m i s c u o u sa c y l a s e s ，i n c l u d i n gd a m i n o a c y l a s e f r o me s c h e r i c h i ac o l i ，a c y l a s e a m a n o ”f r o ma s p e r g i l l u so r y z a ea n di m m o b i l i z e d p e n i c i l l i ng a c y l a s ef r o me s c h e r i c h i ac o l i , t h er e s u l t s h o wt h a tt w oz i n c a c t i v e s i t e a c y l a s e sd - a m i n o a c y l a s ea n d a m a n o ”a c y l a s e sh a v ee x t r e m e l yh i g hm i c h a e la c t i v i t i e s s o m ec o n t r o le x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em i c h a e la d d i t i o nw a sc a t a l y z e db yt h e a c t i v es i t e so fa c y l a s e s b a s e do nt h ea c y l a s em e c h a n i s ma n dc h e m i c a la d d i t i o n m e c h a n i s m , w ep r o p o s e daf e a s i b l em e c h a n i s mf o rt h ep r o m i s c u o u sa c y l a s ec a t a l y z e d m a i c h a e la d d i t i o na n dd e s i g h n e ds o m ee x p e r i m e n t st op r e l i m i n a r i l yp r o v ei t t h ea c y l a s e - c a t a l y z e da z a - m i c h a e la d d i t i o nh a db e e nd e t a i l e d l yd i s c u s s e d t h e i n f l u e n c ef a c t o ri n c l u d i n gs o l v e n t s ，t e m p a t u r e s ，e n z y m ea m o u n t s ，s u b s t r a t ec o n c e t r a i o n s a m ds t r u c t u r eo f d o n o r sa n da c c e p t o r s h a db e e ns y s t e m a t i c a l l ye x a m i n e d t h eb e s tr e a c t i o n t e m p e r a t u r ei sb e t w e e n 4 5 - 5 0o c ：t h er e a c t i o na c t i v i t yi n c r e a s e sa st h ep o l a r i t yo fs o l v e n t d e c r e a s e s ，a n dd m s oi st h eb e s tm e d i af o rh a r d l yd i s s o l v e ds u b s t r a t e s t h ee n z y m a t i c r e a c t i v i t yd e c r e a s e sa st h ec h a i no f t h ea l c o h o l a n dt h es t e r i ce f f e c to fs u b s t i t u t e dg r o u p i n a c c e p t o ri n c r e a s e d a ne l e c t r o n r e j i e c t i n go rs t e r i c a l l yh i n d e t i n ge f f e c to ft h es u b s t i t u t e d g r o u pd e c r e a s e dt h ea d d i t i o nr e a c t i v i t yo fn - h e t e r o c y c l e t h ee l e c t r o nc l o u do nt h e a d d i t i o nna l s oi n f l u e n c e st h ea d d i t i o nr e s u l tg r e a t l y t h ee n z y m e - c a t a l y z e dc a s c a d ea c y l a t i o n m i c h a e la d d i t i o nw a ss t u d i e d as i n g l e a c y l a s e - e a t a l y z e d c a s c a d ea c y l a t i o n m i c h a e la d d i t i o nw a sf i r s ta t t e m p t e da n dn o s a t i s f a c t o r i l y r e s u l tw a so b t a i n e d t h e n ，t h e a c y l a t i o n o fm o n o s a c c h a f i d ea n d a , 1 3 - u n s a t u r a t e dv i n y le s t e rc a t a l y z e db yp r o t e a s e sa n dt h ea c y l a s e - - c a t a l y z e dm i c h a e l a d d i t i o no fp y r i d i n e st oa , 1 3 一u n s a t u r a t e d s u g a r e s t e rw e r ei n v e s t i g a t e dt oa f f o r d1 2 s u g a r - c o n t a i n i n gn - s u b s t i t u t e dp y r i d i n e sd e r i v a t i v e s f u r t h e r m o r e ，a l k a l i n ep r o t e a s ef r o m b a c i l l u ss u b m i sa n dd - a m i n o a c y l a s ec a t a l y z e d - t a n d e ma c y l a t i o n m i c h a e la a d i t i o na n d i n o n e - p o tr e a c t i o no fp y r i d i n e s ，g l u c o s ea n dn ，l b - u n s a t u r a t e dv i n y le s t e rw a ss t u d i e d c o m p a r e dt h er e a c t i o n so fi n d e p e n d e n t l ya c y ! a t i o n ，m i c h a e la d d i t i o na n dc a s c a d er e a c t i o n t oa f f o r d s u g a r - c o n t a i n i n gn - s u b s t i t u t e di m i d a z o l e sd e r i v a t i v e s ，t h ey i e l do fc a s c a d e r e a c t i o ni sl o w e rt h a ni n d e p e n d e n t l ym e t h o d s u s i n gi m i d a z o l e s ，p y r i d i n e s ，p u r i n e s ，a m i n e ，a l c o h o la n dt h i o la sm i c h a e ld o n o r s ，4 4 c o m p o u n d sw e r cs y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yl hn m r ， cn m r ，f t i ra n d e s i - m s 1 2s u g a r - c o n t a i n i n gn - s u b s t i t u t e dp y r i d i n e sd e r i v a t i v e sh a v eb e e nc o n f i r m e dt ob e n e w c o m p o u n d s k e y w o r d s ：c a t a l y t i cp r o m i s c u i t y , a c y l a s e s ，m i c h a e la d d i t i o n , n - h e t e r o c y c l e s ，c a s c a d e r e a c t i o n s 浙江大掌硕士掌位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎江盘鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：镇超签字日期：2 。口 年6 月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿态茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者躲么j 6 超 导师弛z 糖 签字日期：工呷年6 月6 日 签字日期：沙：7 年月乡日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师 指导下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系， 受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公 开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未 经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单 位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名篪越 日期：扫1 年6 月6 曰 第一章绪论 酶促合成方法具有优异的选择性、温和的反应条件吸引了化学、化工、制药、 材料等众多领域学者的兴趣川。酶在有机溶剂中也具有很好的热稳定性与较高的催化 活性，因此非水酶促有机合成方法得到了长足发展【2 川。另一方面，随着基因工程和 酶学的飞速发展，人们发现许多酶不仅具有天然催化功能，其活性位点还能催化一种 或多种其他类型的反应，这些具有催化多功能性( c a m ：i y t i cp r o m i s c u i t y ，又译为催化 混乱性) 的酶无疑为有机合成提供了更多新的催化途径 “。为此，酶在有机介质中 的催化多功能性探索与研究成为一个极具吸引力和挑战性的课题。 m i c h a e l 加成是有机合成中最重要的反应之一【1 2 1 ，1 9 8 6 年k i t a z u m e 掣哪川首先 在水相中实现了酶促m i c h a e l 加成反应，发现某些蛋白酶和脂肪酶在缓冲溶液中可以 催化三氟甲基丙烯酸和水、二乙胺、苯胺、硫酚的m i c h a e l 加成；w h i t m a n 等【1 5 】发现 细菌异构酶4 - o t 和y w t l b 能在缓冲溶液中催化水和3 b 卤代丙烯酸酯的m i c h a e l 加 成。此外，i k e g a m i t l 司和f l i n t l l 刀分别发现了d - 乙酰基丝氨酸硫化氢解酶的迈克尔加成 活性，m a i e r l l 8 】贝0 通过基因工程使ec o l i 菌也具有了催化加成反应的能力。虽然水相 中酶催化的m i c h a e l 加成丰富了酶促合成方法，但很多酶会在水相中催化一些副反应， 同时许多有机化合物不溶于水，这些问题限制了其在有机合成中的应用。 非水酶促方法的发展促进了有机介质中m i c h a e l 酶促加成反应的研究。我们小组 的才滢 1 9 圳】等首先发现脂肪酶和蛋白酶具有催化氮杂环化合物的c - n 键m i c h a e l 加成 的能力。g o t o r t 2 2 1 等和b e r g h i n d 2 3 1 等在甲苯中分别实现了脂肪酶催化的仲氨和硫醇的 m i c h a e l 加成，并用量子化学和定点突变的方法研究了反应机理。有机介质中多功能 性酶催化的m i c h a e l 加成反应极大扩展了生物酶在有机合成中的应用，同对也加深了 研究者对酶催化多功能性的认识。 本文以研究有机介质中酰化酶催化m i c h a e l 加成反应为课题，探索了酰化酶在有 机介质中的m i c h a e l 加成催化新功能，建立了酰化酶催化c - n 键m i c h a e l 加成合成氮 杂环衍生物的方法，研究了酰化酶参与的酰化m i c h a e l 加成串联反应，内容主要包括 以下几个方面： ( 1 ) 研究酰化酶催化m i c h a e l 加成反应的可能性。以氮杂环衍生物、硫醇类化合 浙江大掌硕士掌位能j 文 物以及丙烯酸酯等不饱和羰基化合物为底物，在酰化酶催化下的进行c - n 、c s 、c 0 键的m i c h a e l 加成反应；验证酰化酶活性中心对于m i c h a e l 加成的催化能力；研究酰 化酶催化m i c h a e l 加成反应的催化机理。 ( 2 ) 考察酰化酶催化c - n 键m i c h a e l 加成的影响因素。研究了含有不同类型n h 化合物的c - n 键m i c h a e l 加成，考察氮杂环化合物结构对于反应的影响。以咪唑类 化合物为供体考察受体结构对于酰化酶催化c - n 键m i c h a e l 加成反应的影响；考察 不同溶剂、温度、反应时间等因素对酰化酶催化c n 键m i c h a e l 加成反应的影响； 合成各类结构并具有潜在应用的氮芳香杂环化合物衍生物。建立酰化酶催化 m i c h a e l 加成合成氮杂环衍生物方法。 ( 3 ) 探索酶催化c - n 键m i c h a e l 加成在合成中的应用。研究酰化酶催化酰化 m i c h a e l 加成串联反应及蛋白酶、酰化酶双酶催化酰化m i c h a e l 加成串联反应，通 过酰化反应与m i c h a e l 加成分步反应合成嘧啶单糖酯衍生物。酰化反应主要研究蛋 白酶、酰化酶催化单糖与丙烯酰氧基丙烯酸乙烯酯、丙烯酸乙烯酯以及各类嘧啶取 代的丙酸乙烯酯的反应；m i c h a e l 加成主要研究酰化酶催化丙烯酰氧基丙烯酸乙烯 酯、丙烯酸乙烯酯以及不饱和单糖酯与尿嘧啶衍生物进行的c n 键m i c h a e l 加成； 双酶催化酰化m i c h a e l 加成串联反应主要考察了酰化酶催化m i c h a e l 加成蛋白酶催 化酰化串联与蛋白酶催化酰化酰化酶催化m i c h a e l 加成串联。合成多种具有生物活 性和潜在应用价值的嘧啶单糖酯衍生物，考察实验条件与底物结构对于分步反应及 串联反应的影响。 参考文献： 1 张玉彬，生物催化的手性合成，化学工业出版社，2 0 0 2 ，北京 2 砭t a o ，a m k l i b a n o v , ，a m c h e m s o c ，1 9 9 9 ，1 2 1 ，3 3 3 4 - 3 3 4 8 3 s k o b a y a s h i ，h u y a m a ，s k i m u r a e n z y m a t i cp o l y m e r i z a t i o n , c h e m r e v ，2 0 0 1 ，1 0 1 ，3 7 9 3 - 3 8 1 8 4l f e r r e i r a a , m h g i i a ，j s d o r d i c k ，b i o m a t e r i a l s ，2 0 0 2 ，2 3 ，3 9 5 7 - 3 9 6 7 5r a g r o s s ，a k u m a r , k a l r a b ，c h e m r e v ，2 0 0 1 ，1 0 1 ，2 0 9 7 2 5 1 2 4 6e g a r c i a - u r d i a l e s ，i a l f o n s o ，vg o t o r , c h e m r e x , ，2 0 0 5 ，1 0 5 ，3 1 3 3 5 4 1j h x u j m 0 1 c a t a l b ：e n z 。2 0 0 2 1 8 ，1 9 9 - 2 0 3 8 s d c o p l e y c u r r o p i n c h e m b i 0 1 2 0 0 3 7 2 6 5 - 2 7 2 9 p j o b r i a n , d h e r s c h l a g c h e m ，b i o l1 9 9 9 ，6 ，9 1 1 0 5 1 0 u tb o r n s c h e u e r ，j k a z l a u s k a s a n g e w c h e m i n t e d 2 0 0 4 ，4 3 ，6 0 3 2 - 6 0 4 0 1l j k a z l a u s k a s c u r t , o p i n c h e m 。口f d 2 0 0 5 ，9 ，1 9 5 - 2 0 1 1 2 黄宪，有机合成，上册，高等教育出版社，1 9 9 2 年 1 3t k i t a z u m e ，t i k e y a ，km u r a t a ，c h e m s o c ，c h e m c o m m u n 1 9 8 6 ，1 3 3 1 1 3 3 3 ut k i t a z u m e ，k m u r a t a j f l u o r i n ec h e m j1 9 8 8 ，3 9 7 5 - 8 6 1 5s c w a n g ，e ta 1 ，a n dc p w t l i t m a n za m c h e m s o c2 0 0 3 ，1 2 5 ，1 4 2 8 2 1 4 2 8 3 1 6f i k e g a m i ，i m u r a k o s h ip h y t o c h e m i s t r y1 9 9 4 ，3 5 ，1 0 8 9 11 0 4 1 7d h f l i n t ，j f t u m i n e l l ot j m i l l e r ，b i o lc h e m 1 9 9 6 ，2 7 1 ，1 6 0 5 3 一1 6 0 6 7 1 8t h p m a i e r n a t u r e b i o f e c h n o l2 0 0 3 2 1 4 2 2 - 4 2 7 1 9y c a i ，x f s u n , n w a n g ，x f l i ns y n t h e s i s2 0 0 4 ，5 ，6 7 1 - 6 7 4 2 0 y c a i ，s p y a o ，q w u ，x f l i n b i o t e c h n o ll e f t , 2 0 0 4 ，2 6 ，5 2 5 - 5 2 8 2 1y c a i ，q w u , s p y a o ，y m x i a o ，x f l i n z b i o t e c h n o l 2 0 0 6 ，1 2 1 ，3 3 0 - 3 3 2 2o t o r t e ，i a l f o n s o ，vg o t o r c h e m c o m m u n 2 0 0 4 ，1 5 ，1 7 2 4 - 1 7 2 5 2 3 p c a r l q v i s t , m s v e d e n d a h l 。c ，b r a n n e b y , kh u l t ，tb r i n c la n dp b e r g l u n d c h e m b i o c h e m 2 0 0 5 ，6 ，3 3 1 - 3 3 6 ， 3 - 2 1 引言 第二章酶催化多功能性与酶促合成研究进展 一直以来，酶被认为是一种快速、专一、只对一定反应具有高度识别性的生物催 化剂，而许多具有高度选择性的酶也已被广泛应用于多种有机化合物的合成中【1 5 】。 最近一些研究表明许多酶还具有多重功能，更令人惊奇的是一些酶能够在主反应的活 性位点催化第二种反应，也被称为催化多功能性( c a m l y t i cp r o m i s c u i t y ，又译为催化 混乱性) 或者酶多功能性( e n z y m a t i cp r o m i s c u i t y ) ，同时越来越多的研究证据表明 酶的多功能性非常普遍 6 - 1 0 。 催化多功能性在酶的进化及其二级代谢产物的生物合成上具有极其重要的意义， 对它的研究能为确定酶与酶之间的进化关系提供重要的线索。同时酶的催化多功能性 丰富了酶促有机合成的反应类型，拓展了酶在有机合成领域的应用。进一步地，将酶 的催化多功能性研究与基因工程手段相结合，更可以极大地扩展生物催化剂的应用领 域。本章内容将主要阐述三方面内容：催化多功能性的定义与分类；催化多功能性的 主要研究进展；催化多功能性酶在有机合成中应用。 2 2 酶催化多功能性的定义与分类 多功能性( p r o m i s c u i t y ) 原是免疫学概念，指抗体对于抗原的非特异性识别。这 名词最早被用于酶学是在1 9 9 9 年，h e r s c h l a g 在综述中使用催化多功能性( c a t a l y t i c p r o m i s c u i t y ) 来表示酶活性中心催化非天然底物和非天然反应的现象作为一个新概 念，多功能性在不足十年的研究时间内并没有被严格地定义过，不同作者在对这一概 念的使用中也有分歧。从概念的内涵来区别，酶多功能性不同于催化多功能性，作为 酶的特性，酶多功能性不仅可以表现为酶催化不同类型反应的能力，也表现为酶对一 切非天然反应环境和反应用途的适应能力，所有超出酶天然催化方式的应用都属于酶 多功能性( e n z y m a t i cp r o m i s c u i 哆) 。按照上述标准，酶多功能性可以分为条件多功能 性、底物多功能性和催化多功能性。各类多功能性的定义列在表2 1 中。 表2 1 各类多功能性的定义 类型定义 条件多功能性 酶在各种非天然条件下表现出的催化活性，例如酶在非水介 e n z y m ec o n d i t i o np r o m i s c u i t y 质，极端的温度或者p h 值条件下表现出的催化活性。 底物多功能性 酶表现出对于底物的广泛的和不严格的选择性。 e n z y m es u b s t r a t ep r o m i s c u i t y 催化多功能性 酶( 单一活性位点) 表现出能通过不同的过渡态催化与天然 功能明显不同化学反应催化活性。酶的催化多功能性可以进 e n z y m ec a t a l y t i cp r o m i s c u i t y 一步分为偶然的催化多功能性和人为引导的催化多功能性。 天然的催化多功能性 天然酶表现出对于非天然反应的催化能力。 a c c i d e n t a lc a t a l y t i cp r o m i s c u i t y 人为的催化多功能性通过对天然酶的一个或几个突变而产生的对于新反应的催 i n d u c e dc a t a l y t i cp r o m i s c u i t y化能力。 这种分类方式并不是绝对的，可以发现某种酶催化的反应同时表现出几类多功能 性的例子。例如，使用脂肪酶来催化合成氨基化合物，毫无疑问是脂肪酶的底物多功 能性，但这是否属于脂肪酶催化多功能性的一种? 或者是一种脂肪酶催化的新反应? 许多学者赞同这个观点，但另一些学者认为这两个转化过程过于相似不应该被认为是 不同的反应。在过去的许多文献中也有很多符合多功能性定义的古老例子。早在1 8 9 8 年就有这样的多功能性例子，麦芽糖酶可以表现出与水解相反的活性【l ”；在1 9 0 0 年发 图2 1 酶多功能性的分类 现胰腺酯酶也有相同的特性1 2 1 。在2 0 世纪三十年代早期r o n a 等报道了有关条件多 功能性的例子，他们在一系列试验中发现猪肝脂肪酶和猪胰脂肪酶能在有机溶剂中对 手性醇类和酯类进行拆分【1 3 】；另一个同时具有底物多功能性和催化多功能性的例子是 用丙酮酸脱羧酶来形成碳碳键，最早报道于1 9 2 1 年，至今日已经实现了工业应用1 4 1 。 酶的催化多功能性涉及到酶的一个活性位点催化多于一个化学转化的能力，又可 以进一步分为天然的( 偶然发现的) 催化多功能性与人为的( 通过技术手段诱导产生 的) 催化多功能性。 另一方面，b o m s c h e u e r 和k a z l a u s k a s 认为在酶促转化中，如果断裂或者形成的化 学键不同，或者两个反应的过渡态不同，这样的转化就是不同的。因此详细的机理研 究可以被用来预测已知活性位点的多功能性反应。图2 2 是他们根据参与的官能团和 催化机理对催化多功能性进行了分类，这种分类有助于对不同类型的催化多功能性进 行区别。但是不同反应在图上的位置是经验的，因为官能团和反应的相似程度是主观 判断的。在图中，纵坐标表示主反应活性与催化多功能性在反应机理上差别的大小， 离原点越远则差别越大；横坐标表示断裂和形成键的差别大小；圈表示催化多功能性 的类型，用斜体表示。 翻口e 辨i g 峥 d i f f e r e n t s t e p s p r e s e n t n w n g e e n z 善 g e o m e t r y 量d i f f e r s l g a b o r t e d o rc t _ 。e d c h a r g e 埔辅r i b u t i o n d i f f e r s m e s i m i l a r t n c r e a , - u x j l y d i f f e r e n t z y p e 硝b o n d s b r o k e 槲o r m e d 图2 2 催化多功能性的分类 ! 型竺竺竺堂塑竺竺坚竺墨一流 、诗矽 第一类催化多功能性是以酶催化近似底物的同类反应，也称为底物识别性，这也 是最常见和最明显的催化多功能性( 按照前一种分类方法这类反应属于酶的底物多功 能性) ，因为在表征一种新蛋白质时，就酶对底物的特异识别性进行测试是一项标准。 很多酶都展现出这类催化多功能性，甲烷单加氧酶就是其中的佼佼者之一，除了甲烷 以外，它还可以催化1 5 0 多种类似结构底物进行羟基化反应【l ”。这类催化多功能性同 时也包括因活性位点对反应物不完美控制而产生的结果，如在底物不同位置发生的反 应。例如：苯基4 单氧化酶主要催化甲苯的邻位氧化，但是也能产生大量的间位和对 位氧化产物 1 6 1 。这种不严格的区域效应对酶而言不具有普遍性，但可通过活性位点残 基的简单改变来实现。此外，在酶强迫接受非生理底物的时候也可发现酶对反应物的 不完美控制现象。 第二类催化多功能性则包括了类似结构的官能团，这也是最大的一类催化多功能 性反应。比如，许多蛋白酶能催化酯的水解反应。虽然这两种反应中键的断裂方式不 同( c - n 以及c o ) ，但催化机理非常相似。一些金属蛋白酶能够催化p - o 键m 1 8 】 或者p f 键【1 9 】的水解。同时，一些酯酶能够催化内酰胺中c - n 键的断裂【2 0 - 2 4 ，蛋白 酶能催化硫酰胺中s - o 键的断裂【2 5 】。在商业化应用中，b a s f 公司使用一种天然催化 甘油三酸酯中c 0 键断裂的脂肪酶作为催化剂，通过对映选择性酰化反应来拆分胺， 这个反应形成的是c - n 键【。天冬酰胺酶通常断裂天冬氨酸侧链中的一级胺，也可 以断裂一种类似底物( b 氰基丙氨酸) 中的氰基【2 - q 。丙酮酸激酶通常催化磷酰基的转 移，但它也能够催化磺酰基的转移【2 钔。一些磷酸酶则能够催化硫酸酯的水解【2 9 】。需 要注意的是酶抑制剂，比如丝氨酸水解酶的抑制剂磷酸酯酶不应该包括在催化多功能 性内，因为它们很少参与一个完全的催化转化过程。 最后一类催化多功能性包含了机理的改变。例如，除去一个催化所必须的氨基酸 残基将极大地降低反应速度，但是并不能完全消除这个反应。剩下的效率较低的反应 一定遵循着不同的催化机理。例如，把磷酸酶中的半胱氨酸突变成天冬氨酸，其活性 还是保留了一部分【”】。另一组反应包含了底物辅助催化( s u b s t r a t e a s s i s t e dc a t a l y s i s ) ， 在催化过程中唯一转化的底物是那些具有缺少官能团的底物，使其能够活跃地参与催 化过程【3 1 】。在另一些反应中，立体化学由完全不同的反应机理来实现。例如，环氧水 解酶通过对立体中心的倒转来转化一个对映体，通过立体中心的保持来实现另外一个 对映体的转化 3 2 - 3 3 。这两种途径的机理肯定是不同的，但是目前细节还不明了。 一 2 3 酶催化多功能性研究进展 目前国内外对于催化多功能性的研究工作主要集中在如何获得( 改进) 催化混乱 性上。虽然发现天然酶的催化多功能性具有非常重要的理论和实际意义，但是由于天 然酶种类繁多，许多酶的具体结构也不明确，所以对于目前尚没有一种理论地系统地 方式来指导研究者去发现天然酶的催化多功能性，这一方向的研究中仍然充满了偶然 性。有鉴于此，目前研究者的主要工作都立足于对于已知结构酶的研究，通过研究已 知酶催化多功能性的反应机理，利用生物技术和量子化学模型对酶进行进化，对酶结 构和底物结构进行改造，诱导酶产生催化混乱性。 2 3 1 趋异进化发展酶催化多功能性 扁桃酸盐异构化酶、粘康酸盐内酯化酶和烯醇化酶这几类酶都具有一个相同的局 部反应，被称为m 矿+ 辅助的羧酸a 质子的提取和烯醇化过程。烯醇化中间体随后在 不同的酶作用下形成各自特有的产物。这些酶显示出相似的二级区域结构其中活性 位点处于固定的位置。由于存在这些共同特点，很容易假设这类酶是由同一个祖先通 过趋异进化而来。在一些情况下，这样的进化不仅仅造成底物的特异性，也能造成反 应的特异性。g e r l t 等发现烯醇化酶超家族中的一种存在与n 酰基氨基酸外消旋酶相 同作用的混乱活性，在最佳底物酰基甲硫氨酸条件下其k 。涨m 比值可达5 9 0 m 。s ，与生物体内0 琥珀酰苯甲酸合成酶催化的2 x 1 0 5m 4s 1 表现为多功能性p 5 】。 具有双重活性酶的发现表明在酶开始发展出新功能的同时，至少也有一些保持了原有 的催化功能，这导致酶表现出天然的催化多功能性。 图2 3m f + 辅助的羧酸小质子的提取和烯醇化过程 趋异进化( d i v e r g e n te v o l u t i o n ) 是从同一个祖先创造出不同种类的自然过程。 这个过程同样也发生在分子领域一创造出具有新催化活性的酶。酶的新活性来自于基 因复制和其后副本的新活性的进化3 6 1 。这里有两个自然趋异进化的例子：“b 折叠水 解酶超族m 3 8 】和烯醇酶超族【蚓。邮折叠水解酶超族的酶都包含亲核性催化过程， j 型坐坚丝竺竺坠坚竺笠一 、矽 但也具有很广泛的底物和反应识别性，如酯或肽的水解活性( 丝氨酸作为亲核试剂) 、 脱卤酶活性和环氧化水解酶活性( 天门冬氨酸酯作为亲核试剂) 。烯醇化酶都具有相 似的活性位点，通常催化转移一个质子到羧酸的反应( 由二价金属辅助的一般酸催 化) ，形成烯醇中间体。由烯醇酶超族催化的其他反应包括外消旋化( 扁桃酸酯、 _ 酰基氨基酸) 和b 一消除。 一个令人惊奇的新活性能够快速自然进化的例子是莠去津氯水解酶( a t r a z i n e c h l o r o h y d r o l a s e ) ( 图2 4 ) 】。莠去津是一种杀虫剂，在二十世纪五十年代被广泛 使用，同时不能在泥土中降解。但自从1 9 9 3 年开始，很多研究小组都发现了莠去津 的快速降解。在这一生物降解中起关键作用的是莠去津氯水解酶，它能够催化裂解碳 一氯键：这种酶与三聚氰氨水解酶仅有八个氨基酸的不同，而后者的功能是催化三聚 氰氨中c n 键的水解。三聚氰胺承解酶只有很低的莠去津氯水解酶活性，而新的酶 却没有三聚氰胺水解酶的活性。通过定点进化可以进一步扩展莠去津氯水解酶的底物 范围，包括c - - s 键和c - - o 键的断裂【4 ”。另一个快速自然进化的例子是降解杀虫剂 对硝苯磷酸的磷酸三酯酶的进化【4 2 】。 9 = 8 1 粤1 8 _ “k m e l a m i n e n ，f 叩时0 h y d 吲8 ”n ，i 2h y d r 0 a * n 火於h 人 俐儿人n h 2 hh 。 m e l a m i n e 图2 4 从三聚氰氨水解酶自然进化而来的莠去津氯水解酶。 2 3 2 定点突变发展酶催化多功能性 2 0 0 5 年kl m o r l e y 和r j k a z l a u s k a s 发表了他们的研究成果，他们通过单一的突 变来增强酶的催化多功能性，以此寻找能够更有效的影响活性位点突变位置【4 3 1 。他们 在实验中估计了所有能够增强多功能性的单一突变到活性位点的距离，之后利用自由 能作为标准来对由这些突变而造成的多功能性增强进行比较。例如，差向异构酶 l - a i a - d l - g i u 中的突变a s p 2 9 7 g l y ( 到活性位点l ，y s 2 4 7 的距离为8 4a ) 增强了0 - 琥 珀酰苯甲酸合成酶活性2 4 0 0 倍。根据公式2 1 ，这个增强对应的自由能增强是4 6k c a l m o l - 1 。 浙江大掌硕士掌位论文 g = r t i n 研究结果表明，距离活性位点更近的突变( 到活性位点的距离小于1 0a ) 比起距离 活性位点较远的突变来能够更好的增强酶的催化多功能性( 图2 5 ) 。但是另外几个 令人印象深刻例子并没有包括其中，例如突变糖苷酶为甘油化酶和2 巯基乙醇酶。这 是因为未经突变的酶没有催化多功能性i 删。虽然一些结果并不能认为完全是功能的增 强，但是也出现了显著的提高。这样的实验结果说明，对接近活性位点的氨基酸进行 突变是增强酶催化多功能性的有效途径。 0 51 01 52 02 5 o 崤b eb w 豫、ak e va c v e 搬a t o m a 伪e c o o f t h er n u 乜